中药发酵新技术

发酵是指利用生物体（包括微生物、植物细胞等）的代谢功能，使有机物分解的生物化学反应过程。以适宜的培养基为营养，通过微生物的生长代谢和生命活动产生丰富的次生代谢产物。借鉴中医药组方思想，将单味中药、具有类似或协同作用的中药进行发酵，目的是产生新化合物、增强功效或者降低单一药物不良作用。中草药经发酵、生物转化后，其有效成分能被充分分离、提取；经生物转化更具有生物活性，在中药现代化过程中具有重要地位。中药的发酵工程和酶工程已被列为国家科技部“十五发展规划”中的重要项目之一；黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨中科生物工程有限公司联合开发的中药发酵制剂是实现中药现代化、具有高科技水平的新技术、新产品

1中药发酵的历史和现状

1.1中药发酵的历史

发酵中药的应用在我国具有悠久的历史，是传统中药加工炮制的重要方法之一，发酵中药作为一种炮制、加工工艺，不但改变了煎、煮、熬、炼、蒸、浸的传统工艺，而且使药效提高、药性发生改变。如中药淡豆豉为桑叶或麻黄等的发酵品，不同的培养基经同样的微生物处理后会产生药性的差异，利用该特性可生产不同适应症的中药，发酵淡豆豉时以桑叶、青蒿发酵者，药性偏于寒凉，多用于风热感冒或热病胸中烦闷之症；以麻黄、紫苏发酵者，药性偏于辛温,多用于风寒感冒头痛之症［2］，以上中药的炮制过程是微生物发酵中药复合体系的建立过程。目前临床应用的发酵(制品)中药主要有神曲、半夏曲、淡豆豉、豆黄等，其工艺均为固体发酵。

1.2中药发酵的现状

除传统的中草药炮制，以中草药发酵生产药物的研究起步较晚，20世纪80年代的研究主要集中在真菌类自身发酵产生次生代谢，如灵芝菌丝体、冬虫夏草菌丝体发酵等,多为单一发酵［3］。现代利用中草药发酵的研究已从单味药涉及到复方研究且取得显著成果，成药片仔癀即是用麝香、牛黄、蛇胆、三七等名贵中药的微生物发酵物,为临床退黄、消肿的良药；三株口服液属营养保健食品，它以大豆芽为原料，在牛肉汤、大豆芽浸液、酵母膏、蔗糖、葡萄糖中加入双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和DL菌联合发酵制成，产品有益于保持胃肠道健康。杨海龙等［4］借助真菌灵芝产生的丰富酶系通过对薏苡仁的转化，使薏苡仁的主要成分发生了变化。“康复灵”为抗癌验方，主要成分有灵芝发酵菌、党参、麦冬、猪苓、薏苡仁、淮山药等，经生物发酵转化后多数样品具有抑制小鼠/180肉瘤生长的作用［5］。以上中药发酵成功的事例充分说明微生物发酵已成为中药现代化研究的重要内容之一。

国外对于中药发酵的研究报道较少，主要在食品、酶工程，如日本的纳豆，用Bacillus菌发酵大豆，因为Bacillus菌酶系丰富，包括淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶，且能增加维生素K含量，Bacillussubtilis菌环能消除小肠内致病菌，其提取物具有明显的抗癌活性和降压作用［6］。中草药发酵的研究有必要借鉴上述成功的经验。

2发酵在中药研究中的应用

2.1提高有效成分提取率

中草药中植物类药材占90％，药材有效成分多存在于胞浆中，植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成的致密结构。在中药有效成分提取过程中，当胞浆中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力，使有效成分浸出受阻。微生物可利用中药中的成分为营养进行分裂、生长、繁殖和代谢，在代谢过程中分泌蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等几十种胞外酶进入培养基，使细胞破裂，细胞间隙增加，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力。体外试验证明对盾叶薯蓣采用预发酵有效组分薯蓣皂苷元的产率明显提高［7］。

2.2提高有效成分的吸收和利用

传统中草药给药途径多采用口服，小分子活性物质易通过血脑屏障而与人体细胞蛋白结合,因而比大分子物质具有更高的活性。药物中的有效成分在进入肠道后与肠道菌群发生关联，某些成分经细菌的作用发生代谢转化后被吸收，体内环境中肠道菌群是完成中药有效成分代谢的重要因素之一。研究证明多种中药有效成分被肠道菌群代谢后发生转化，产生出具有较强药理活性的代谢产物。如大豆异黄酮主要以9种异黄酮糖苷和3种相应的配糖体组成，经肠道微生物作用，部分糖苷脱离释放出游离式的二羟基异黄酮(大豆苷元,daidzein)和三羟基异黄酮(染料木黄酮,genistein)，这两种异黄酮可以被机体有效吸收［8］。中药经发酵处理更有利于有效成分的吸收和利用。

2.3产生新化合物

王玉红等［9］在灵芝发酵过程中加入黄芪，结果发酵液中多糖的组分发生变化,有可能产生新的物质。李国红［10］用枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn对三七须根进行发酵，得到5个新化合物。微生物在分裂、生长、繁殖和代谢过程中可将中草药的成分分解转化，由于中药的某些物质可能对微生物的生长代谢及活性成分的产生有促进或抑制作用，微生物在中药的特殊环境中也有可能改变自身的代谢途径，在生长过程中产生丰富的初生或次生代谢产物，或以中药中的有效物质或一些非有效物质为前体，经酯化、氧化、葡萄糖基化、异构化、甲基化、去甲基化、乙酰化等多种生物转化形成新的化合物，发酵具有反应选择性强、反应条件温和、副产物少、不造成环境污染和后处理简单以及可以进行传统有机合成所不能或很难进行的化学反应等优点［11，12］，具有一般化学反应无法比拟的优点

2.4减毒增效

微生物有可能将中药中的有毒物质进行分解,从而降低药物的毒副作用。喜树碱具有较强的抗肿瘤活性,同时又具有严重的胃肠毒性，如抑制骨髓功能和引起出血性膀胱炎等，制约了它在临床的进一步应用，10-羟基喜树碱是喜树碱的结构类似物，对多种癌症具有显著的疗效，且毒副作用很小，但它在喜树中的含量仅为十万分之二，提取分离费时、费力，朱关平［13］采用无毒黄曲霉菌株1100T-419将喜树碱转化为10-羟基喜树碱，转化率达50%以上。

大黄生用泻下作用峻烈，易引起腹痛、恶心等胃肠道反应。大黄泻下成分主要是结合性蒽醌衍生物，其中以二葸酮番泻苷的作用最强。在中医临床中，为了缓和大黄的泻下作用及对胃肠道的不良反应，常用不同的炮制方法，使结合性蒽醌分解或破坏，从而缓和泻下作用和其它副作用，研究用酵母菌发酵大黄，结果大黄总蒽醌含量略有降低，结合型蒽醌含量降低，分离型蒽醌含量增加，起到减毒增效的作用［14］。

3中药发酵的关键问题

3.1筛选适合发酵的药材

包括单味药或复方。达b等［15］研究了猴头菌转化银杏叶提取物对四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠血糖水平的影响，结果表明猴头菌转化银杏叶提取物的转化产物的降血糖能力明显提高。李国红等［16］曾利用枯草芽孢杆菌（Bacilllussubtilis）对50种中药进行发酵，检测发酵产物与原料对结核分支杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）和榛色青霉菌（Penicilliumavellaneum）的抗菌活性。结果表明连翘等中药的发酵产物抗菌活性增加，而苦参等中药的发酵产物抗菌活性降低，部分中药的活性不变，说明并非所有药材发酵都能增加疗效的，筛选针对某一活性功能的发酵的药材是中药发酵研究的基本工作。徐启华等对中药复方玉屏风散煎剂进行发酵，结果玉屏风散发酵液对小鼠的免疫功能增强，疗效要强于玉屏风散煎剂［17］。

3.2适合发酵的菌种

传统中药发酵多用自然菌，如中药淡豆豉。蔡琨等［18］用纯种发酵淡豆豉以染料木素和大豆黄素为指标检测主要有效成分，结果认为纯种发酵可以保证淡豆豉生产的稳定性和产量的提高。张玲琪等［19］从长春花茎的韧皮部中分离出一种内生真菌，用该真菌发酵长春花产生抗癌药长春新碱。此方面研究涉及自然菌、内生菌和特种菌，哪类菌种更适合中药发酵需进行深入研究。

3.3中药发酵条件优化

徐启华等［17］选取不同菌种如两株酵母菌、培养基如培养基即YPD、PDA和麦芽汁发酵中药复方玉屏风散，观察腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力,间接反映药效改变情况，结果表明，玉屏风散经用酵母菌进行生物转化后,明显提高了小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能以及明显增强了巨噬细胞和T、B淋巴细胞的增殖能力。不同菌种、培养基、温度、湿度、发酵时间等条件是中药发酵的具体、关键因素。

3.4活性成分的筛选

由于中药自身体系模糊，微生物生长特性的多样性，发酵后会产生更多的化合物，发酵产物综合研究--分离、纯化等条件的优化，从复杂的发酵产物中分离出有效成分是中药发酵的关键，活性筛选应侧重方法的可行性和实用性，以细胞和分子水平建立的高通量药物筛选体系可测定的信号，如颜色、荧光、免疫反应、发光、放射性等，做到简单、有效、可行、可靠。

3.5筛选合理的药理模型

合理的药理模型是发酵产物活性成分筛选的重要保障，药理实验更加明确微生物的性质以及变化过程，筛选能够分泌特异性作用于活性物质的体内外实验，因为相对于体内实验而言体外实验更省时、省力、成本低、筛选量大，体外实验适合大量筛选。徐萌萌［20］利用微生物发酵过程中产生的酶系,建立苷类中药体外转化模型,将苷类物质转化为相应的苷元,有效提高了活性成分的生物利用度。其次，对中药也应该进行成分与药理作用的全面研究，深入研究中药多靶点作用的机理，并用相应模型进行科学的阐述，进而建立中药多靶点作用的模式。最后将发酵产物与天然产物的对比研究，通过对发酵产物与天然产物的成分、药理药效及毒理对比，寻找目前比较紧缺天然产物的替代品。合理的药理模型往往会起到事半功倍的效果。

4展望

对中草药的成分进行生物转化，通过药理筛选模型来确定转化前后药效的变化，需要中药学、微生物学、分析化学、药理学等多学科参与。随着多学科的交叉发展，微生物发酵中药的研究必将取得一个长足的发展，微生物发酵中药也必将在中药现代化进程中表现出强大的生命力。有学者呼吁中药发酵制药可按新药审批办法规定开发新药，正在修订中的我国新药申报指导原则,已决定将生物转化列入创新(一类)药的研究。中药成分的生物转化将成为中药创制新药研究的重要方面。因此，应用现代生物技术大规模工业化提取中草药的有效生物活性成分，发展具有中国特色的生物技术医药工业具有广阔的前景。