葛根素的提取及结构改造

摘要：为了探索有效的提取工艺和寻求合适的方法以提高葛根素的脂溶性和水溶性，利用醇提法从野葛中提取葛根素，在此基础上，利用化学合成的方法对葛根素的结构进行了改造。实验结果表明：葛根素收率为1.41%，纯度为97%；合成的两种新化合物为3@－亚甲基－六氢吡啶-葛根素和3@－亚甲基－四氢吡咯－葛根素。

关键词：野葛根葛根素提取结构改造

葛根素是由豆科植物野葛（Pueraria lobata(wild.)Ohwi）或甘葛藤（Pueraria thomsoniiBenth.）的干燥根中分离提取出的一种黄酮苷，化学名为4′,7-二羟基－8－D－葡萄糖基异黄酮。作为改善心脑血管循环的新药，葛根素毒性小、安全范围广、疗效好而极具临床应用价值。但由于科技投入的不足，生产效率低，能耗大，产品缺乏竞争力。另外，由于其异黄酮结构水溶性和脂溶性都较差，生物利用度低，限制了它的广泛应用。目前，临床应用的葛根素注射液大多需加入高浓度的丙二醇才能达到该注射剂要求的药物浓度，这样使药物的粘稠度较大，亦给生产造成过滤上的麻烦，成本增加。实验证明大鼠灌胃和临床口服葛根素的生物利用度都比较低，这在一定程度上影响其疗效的发挥。因此，探索有效的提取工艺和寻求合适的方法提高葛根素的脂溶性和水溶性，对提高其生物利用度，增强药理活性具有重要意义。本研究在从野葛中提取葛根素的基础上，对其提取物葛根素进行了结构改造。同时，考虑到葛根素的水溶性和以往对葛根素的结构修饰主要集中在酚羟基和糖C－6??醇羟上，本研究在3@或5′位引进不同的Mannich碱，以期增强其药理活性。此方法不但避免了葛根素的主要官能团－酚羟基被也结合或屏蔽，也可以为异黄酮类化合物的结构修饰提供一种新的方法。

1材料与方法

1.1 实验仪器与药品

1.1.1仪器设备

紫外－可见分光光度计（HITACHI557,美国），红外分光光度仪（HITACHI220-50，美国DELL公司），核磁共振分析仪(MERCURY400BBP，美国),旋转蒸发仪(RE120，德国)，分析天平，量筒，100ml三口圆底烧瓶，100ml、50m滴液漏斗，100ml分液漏斗，500ml三角瓶，水泵，蒸馏装置（包括常压蒸馏和减压装置），磁力搅拌器，紫外灯，80×3cm层析柱，薄层层析板，电热套，滤纸等。

1.1.2试剂药品野葛根(购自兰州佛慈制药厂，产地陕西，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所鉴定)，葛根素标准品(中国药品生物制品检定所)，薄层层析硅胶G(青岛海洋化工有限公司)，柱层析硅胶（青岛海洋化工分厂，粒度：200－300目）。酸性三氧化二铝、正丁醇、氯仿、六氢吡啶，四氢吡咯，氯仿，乙醇，95%乙醇，无水吡啶、甲醇(均为分析纯)，氢氧化钠（固体），无水硫酸镁（均为化学纯），羧甲基纤维素钠(CMC)。

2 实验方法

2.1 葛根素的提取

采用醇提法，即称取葛根2000g于三口圆底烧瓶中，加入95%乙醇2000mL,在水浴锅中（58-60℃）热浸29h，过滤，滤液备浓缩为浸膏。将浸膏用400mL水饱和正丁醇和400mL正丁醇交替溶解，即在旋转蒸发仪上旋转振荡1h，静置2h，吸取上清液。上清液用水进行萃取，萃取液浓缩至原体积的一半，再用正丁醇萃取，正丁醇萃取液经三氧化二铝柱脱色，再经减压浓缩，浓缩液静置析出后，抽滤并经自然干燥得粗制品0.75kg。取粗制品75g，加入95%的冰醋酸262mL，加热至116℃溶解，并结晶得精品28.2g。

2.2 葛根素的结构改造

2.2.13@－亚甲基－六氢吡啶-葛根素的合成

在三口圆底烧瓶中加入37％－40％的甲醛溶液10mL，在冰浴冷却的情况下，用滴液漏斗滴加23mL六氢吡啶，维持反应温度在40℃左右，。滴加完毕后，室温继续搅拌2小时，静置，溶液出现分层现象，上层为淡黄色的有机层，下层为水，移至分液漏斗，分出上层，加氢氧化钠干燥，过滤，减压蒸馏，收集85℃－90℃的馏分。精确称取0.416g葛根素精品与三口圆底烧瓶中，加10mL无水吡啶溶解，溶液显黄色，用滴液漏斗缓慢滴加0.4027g馏分。加热搅拌回流，TLC跟踪反应，反应约需8小时，所得反应液用薄层层析板进行分离（CH3Cl－CH3OH，2：1），得到淡黄色的晶体（106mg，收率26％）。其合成路线如下：

2.63@－亚甲基－四氢吡咯－葛根素的合成

在三口圆底烧瓶中加入37％－40％的甲醛溶液10mL，在冰浴冷却的情况下，用分液漏斗滴加16.8mL四氢吡咯，温度一直保持在50℃以下，同时用磁力搅拌器搅拌，滴加完毕，室温继续搅拌2小时，静置，溶液不分层，深红色的液体。加氢氧化钠干燥，放置，过滤，减压蒸馏，收集100℃－105℃的馏分。精确称取0.832g葛根素精品与三口圆底烧瓶中，加20mL无水吡啶溶解，用滴液漏斗滴加0.308g馏分，加热搅拌回流，TLC跟踪反应，反应约需5小时，停止反应后减压蒸除溶剂，所得产物经硅胶柱分离（CH3Cl－CH3OH－H2O，95：30：3），得到深红色的固体结晶（83mg，收率10％），其合成路线如下：

2.3.葛根素及其衍生物的结构鉴定

2.3.1葛根素提取物的纯度分析

称取干燥至恒重的葛根素5mg，于25mL容量瓶中，加95%的乙醇溶解并稀释至刻度,吸取0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL溶液

图3葛根素样品HNMR图谱

置10mL容量瓶，以1.0mL95%乙醇精密加水至10mL，摇匀。同时以1.0ml95%乙醇加水至10mL作空白对照，在250nm波长处测定吸收度。处理数据，得回归方程为：A=0.0658C+0.2469，r=0.9997。按文献，采用紫外-分光光度计，精密称取葛根素25mg于50mL容量瓶中，加95%的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取1.0mL于25ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，取1.0mL乙醇同样稀释作空白对照，在250nm处测定吸收度由回归方程计算出产品中葛根素的纯度。

2.3.2红外光谱鉴定

红外光谱采用岛津IR-440型红外光谱仪，KBr压片法测定，扫描波长500－4000cm－1。

2.3.3核磁氢谱（1H NMR）鉴定

将葛根素提取物及其衍生物溶于氘代甲醇（CD3OD-d4）中在Mercury400MHz核磁共振仪上测定氢谱，以四甲基硅烷（TMS）为内标物。

3.结果与分析

3.1 葛根素提取物的收率和纯度

由2.1和2.3.1可得出葛根素的收率和纯度分别为1.41%和97%。

3.2红外光谱分析

葛根素提取物的IRυKBrMax（cm-1）：3398，1630，1584，1515，1443，1384，1257，1178，1118，1081，1041。与葛根素标准品的红外数据基本一致：3370，1631，1607，1514，1447，1396,1273,1210，1103，1059，1008。

3@－亚甲基－六氢吡啶-葛根素的合成IRv max（KBr）cm－1：1626、1280、1441、3375、1064、2929、1499、1550、1532、2282、1709、1725。其中3250－3450间的宽带（3375）是由氢键缔合的羟基的伸缩振动引起；1709处的强吸收峰是分子中存在的C=O的明显例证；1626、1532、1550、1499、1441是苯环的骨架振动引起的典型吸收；1280、1064表明分子中存在C-O－C结构。

3@－亚甲基－四氢吡咯－葛根素的合成IRv max（KBr）cm－1：1123、3404、16251279、1441、1386、1550、1512、 615、1531、798、1708、2282、1724、3717、23483250－3400或3404宽带（－OH），1708（C=O），1625，1512，1550，1531，1441，1386（苯环），1279，1123（C-O-C）。

3.3核磁氢谱（1H NMR）鉴定

葛根素提取物1HNMR（CD3OD-d4，400MHz，TMS内标）：δ:8.04(1H,d,J=9Hz;C5-H)，6.98(1H,d,J=9Hz;C6-H)，7.36(2H,d,J=9Hz;C2′,6′-H)，6.98(2H，d，=9Hz；C3′,5@-H)，8.14(1H，s;C2-H),5.09(1H,d,J=10Hz;C1?-H)。

3@－亚甲基－六氢吡啶-葛根素1HNMR（CD3OD-d4，400MHz，TMS内标）：δ：8.144（1H，s；C2-H），7.97（1H，d；C5-H），7.30（2H，d，C2@，6@-H），6.91（1H，d，C6-H），6.81（1H，d，C5@-H），5.07（1H，d，C1″-H），3.84（2H，s，Ar-CH2-），2.72（4H，s，－NCH2－），1.68（6H，t，－CH2CH2CH2-）。

3@－亚甲基－四氢吡咯－葛根素1HNMR（CD3OD-d4，400MHz，TMS内标）：δ：8.249（1H，s；C2-H），8.05（1H，d；C5-H），7.43（2H，d，C2@，6@-H），6.98（1H，d，C6-H），6.95（1H，d，C5@-H），5.07（1H，d，C1″-H），4.279（2H，s，Ar-CH2－），1.985（4H，t，－NCH2-），1.296（4H，t，－CH2CH2-）。

4.讨论

采用紫外分光广度法对产品中葛根素的含量及纯度进行了检测，所得产品葛根素收得率为1.41%，纯度为97%；潘娓婕等利用酸水解法所得葛根素收得率为1.36%，纯度为98.32%，而张尊听等分离所得葛根素产率为1.2%，纯度为93.4%。对比发现葛根素收得率比上述两者都高，纯度略低于前者，因此该工艺可进行工业化试生产。

由于大部分药物的疗效是由药物分子与生物受体分子间的相互作用而产生，因此，药物分子的溶解性能及分子的大小、形状和空间结构都很重要。由此我们设想通过结构修饰来改善葛根素的水溶性和脂溶性，并改变其空间结构，从而影响葛根素的药理活性。但目前对葛根素的结构修饰主要集中在酚羟基和糖C－6??醇羟基，但反应过程中结合和屏蔽了葛根素的主要官能团－酚羟基，从而降低了物质本身的生物活性。本试验利用Mannich反应在葛根素的4′－OH的邻位引进了碱性基团，该基团可与酸结合生成盐，由于盐类物质易溶于水，因此可显著改善葛根素水溶性差的缺点，同时避免了与其主要管能团－酚羟基发生反应。

王昕等对国内外文献报道的近四十种葛根黄豆甙元结构改造产物进行了对比，利用分子药理学理论，讨论了其结构与抗缺氧及雌性激素作用的关系，对比研究发现，一般吸电子基团的取代对抗缺氧作用不利；邵国贤等根据抗缺氧实验观察到一般吸电子基团的取代对抗缺氧作用不利，而供电子基团则有利于抗缺氧，推测可能是异黄酮的毗喃酮环上的氧原子的电子云密度与抗缺氧作用有关。葛根素是异黄酮类化合物，其生理活性与抗缺氧作用存在着极为密切的关系。据此推测本试验合成的2种新化合物其3′或5′取代基都是供电子基团，故有利于抗缺氧作用，但是否具有比葛根素较强的药理活性有待进一步研究。