新生隐球菌病研究进展

摘　要：隐球菌是条件致病性深部真菌，易发于细胞免疫功能受损的人群。新生隐球菌是隐球菌属的重要致病菌，属环境腐生菌，可从土壤和鸽粪中分离到，并被认为是人和动物最主要的传染源。医学方面，近年来由新生隐球菌引起的感染有逐渐增多的趋势，主要引起人的脑膜炎和肺炎。动物医学方面，可引起马的呼吸道病、牛羊的乳腺炎。鸽是隐球菌的自然宿主，但并不引起发病。该文从隐球菌病的病原特征、分类、毒力因子、致病性等生物学特性进行了概述，并对人和动物新生隐球菌病的传染和流行的基本环节、发病机制、临床表现、防治等方面的研究进展进行了综述。

关键词：隐球菌病；新生隐球菌；防治

新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)为酵母样，呈圆形或卵圆形，芽殖，细胞直径为4 μm～20μm，在组织中菌体较大，经培养后变小，均有胶样物质的黏多糖荚膜，厚约1 μm～2μm，是一种特异的可溶性半抗原，分为A、B、C、D和AD5个血清型，临床分离株多为A和D型。澳大利亚环境中分离出的新生隐球菌以血清B型为主，占67.7%，与该国桉树的分布广泛有关。国内报道从临床分离的新生隐球菌83%～89%为新生变种，17%～19%为格特变种，我国致病性隐球菌血清型分布的特点是：以A型为主，D型少见，有少量的AD型，缺乏C型。

医学方面，1894年从人体和桃汁中分离并确认新生隐球菌为一种人类致病性病原微生物。隐球菌病主要侵犯中枢神经系统和肺脏，亦可原发或继发于皮肤、黏膜、骨骼、肝脏等器官。病情呈急性、亚急性或慢性过程。尤其多发于免疫功能低下的***、大剂量应用糖皮质激素及抗肿瘤化疗药物的病人、肿瘤患者、获得性免疫缺陷综合征患者(Acquiredimmunodeficiency syndrome，AIDS)，以及使用抗移植排斥药物的病人。

本病的感染者遍布于全世界，我国北京、上海、天津、宁夏、广东等10多个省市均有报道，且发病率有逐渐增多的趋势。

动物医学方面，犬、猫、猪、牛、马、猴、兔、鼠和禽类都易感染本病。可引起马的呼吸道病，牛的急性乳腺炎，乳房淋巴结肿大，乳汁浓稠呈灰白色。如果饮用污染的生牛奶，则会危害公众健康。鸽带菌但不发病。

在我国医学方面，对新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)已进行了较系统的研究。生态学方面，由鸽粪分离的环境株具有表型的多态性，包括新生变种的A、D血清型及尿素酶阴性株，而这些多态性菌株均已在临床发现。在病原分子生物学方面，G＋Cmol%和核型已被进行分析。临床方面，研制的一种新的可同时检测酚氧化酶和尿素酶的培养基可用于该菌的临床鉴定。使用一种高渗培养基诱导出于该菌的L型，提示在感染期间L型的形成可能与该病的慢性过程与复发有关。已证实氟康唑对治疗新生隐球菌病有良好的效果。进一步应重视联合治疗的可能性，例如使用氟康唑加两性霉素B脂质体。总之，在我国对新生隐球菌的系统性研究已经开始进行，并将取得许多有意义的进展。

1　隐球菌的分类和生物学特性

1.1　隐球菌的分类

隐球菌属包括17个种和7个变种，根据新生隐球菌多聚糖荚膜成分和生化方面的差异，人们将新生隐球菌分成3个变种。新生隐球菌按血清学分为A、B、C、D和AD型5个型。新生变种(Cryptococcusneoformans var neoformans，血清型D)、grubii变种 (C.neoformans vargrubii，血清型A)和格特变种(C.neoformans vargattii，血清型B、C)，此外，还发现了新生变种和grubii变种的杂合体(血清型AD)。但目前被认定的是2个变种，即新生变种A、D型和AD，格特变种的B和C型。

1987年，国内9个地区60株新生隐球菌中，A型占多数，D型少见，有一定比例的B型和AD型，未见C型。新生隐球菌的格特变种则是一种可以真正引起健康个体感染的病原菌，主要见于热带和亚热带地域。

1.2　生物学特性

隐球菌(Cryptococcus)为直径4 μm～8μm的圆形或卵圆形厚壁孢子，内有大小不等的颗粒，周围有黏多糖构成的宽阔而有折光性的胶质样荚膜，后者具有抗原性，且与隐球菌的毒力有关。有时可见出芽孢子，但无菌丝。隐球菌其无性生殖阶段属于半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球菌酵母目、隐球菌酵母科、隐球菌酵母属；其有性阶段属于担子菌亚门、冬孢菌纲、黑粉菌目、黑粉菌科、拟线黑粉菌属。

新生隐球菌属不全菌类隐球菌目、隐球菌属，是一种酵母样真菌。新生隐球菌在组织中呈圆形或椭圆形，直径为4 μm～6 μm，个别达20μm。革兰氏染色阳性，过碘酸锡夫染色(Periodic-Schiffstain，PAS)菌体呈红色，菌体为宽厚透明的荚膜，荚膜比菌体大1倍～3倍。

培养特性方面，本菌在培养基上生长的菌落为酵母型，初为乳白色，逐渐转为棕黄色。普通培养基生长良好，生长最适宜温度为30℃。隐球菌荚膜的主要成分荚膜多糖是确定血清型特异性的抗原基础，并与其毒力、致病性及其免疫性密切相关。

生化特性方面，该菌可在37℃生长，产生荚膜，尿素酶试验阳性(少数为阴性)，是隐球菌属中惟一的能产生酚过氧化酶而分解含有二酚或多酚化合物而使培养基底物产生黑色素的种。油菜籽和咖啡酸玉米琼脂就是利用此特点来做菌种的鉴定。另外，能产生黑色素也是判断是否为毒力株的一个指标。利用这些独特的生物学特性，可以用于鉴定，特别是尿素酶阴性株的鉴定。

主要致病菌种为新生隐球菌新生变种、格特变种和grubii变种。已报道可引起人类疾病的还有浅黄隐球菌、浅白隐球菌和罗伦特隐球菌等，但均较少见。

2　流行病学

新生隐球菌广泛存在于土壤和鸽粪中，偶可在水果、蔬菜、牛乳以及健康人体的口腔、鼻腔、咽部、胃肠、皮肤等处分离到。隐球菌病在世界各地均有发生，可发生于任何年龄组，以20岁～30岁的人群多发，儿童相对少见。较多发生于男性，呈散发性分布。我国新生隐球菌血清型分布以A、D型为主，尤其是A型。TietzH J等活检研究柏林一地区内源性深部真菌病的病人，发现隐球菌病发病率位于第三。

2.1　传染来源

新生隐球菌是一种广泛存在于自然环境中的条件致病菌，可从水果、蔬菜、土壤、桉树花和各种鸟类排泄物中分离出，其中从鸽粪中分离出的新生隐球菌被认为是人类感染的最重要来源。

鸽粪是新生隐球菌新生变种临床传染的重要来源，中性、干燥鸽粪易于本菌的生长，其他禽类如鸡、鹦鹉、云雀等的排泄物亦能分离出隐球菌。

桉树是新生隐球菌格特变种的主要来源，澳洲的树袋熊为其携带者。

MalikR等用抗隐球菌抗体检测正常的猫、狗、马、树袋熊的血清抗体水平，对患有隐球菌病的狗和树袋熊用酶免疫测定；80%以上有隐球菌感染的猫和狗的抗体水平在诊断、发病期间、成功治疗后升高；“正常”的动物中抗体检测提示猫和狗先前感染率为10%，马为3%，树袋熊为5%。

新生隐球菌格特变种是桉树的寄生菌，属致病菌。有文献报道，由格特变种所致隐球菌病的发病率和地区分布与桉树尤其是赤桉树和细叶桉树的种植和分布有密切关系。澳大利亚桉树在世界范围内广泛引种(包括我国在内)，因此，对于我国引起临床感染的格特变种与桉树或其他自然环境的关系仍需进一步调查，从而有可能彻底预防隐球菌感染的发生。

2.2　传播途径

一般认为由呼吸道吸入为隐球菌主要的传播途径，引发肺部感染，进而累及其他部位。消化道可能是另一种途径，由皮肤直接侵入也可能是一种途径。

2.3　易感宿主

人群对隐球菌普遍感染，以青壮年较多见，男性多于女性。但有一定的自然免疫能力，很多健康人群可能感染但不导致疾病的发生。感染多发生于免疫功能低下者，如大剂量应用糖皮质激素、化疗药物等。肿瘤、AIDS以及移植后抗排斥药物的使用等也易诱发本病。AIDS患者中新生隐球菌病是最常见的能引起生命危险的真菌病，估计AIDS患者中的感染率为5%～10%，发达国家应用人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus，HIV)三联疗法感染率有所下降，但在像乌干达这样的发展中国家发生率依然很高。

欧盟医学真菌基金2001年发表的在奥地利、德国、瑞士调查隐球菌病的流行病学资料表明，AIDS依然是最重要的危险因素(60%)。研究表明，20%～60%的HIV阴性隐球菌病人发生于器官移植接受者，同时表明，在这些病人中隐球菌进展更为迅速，这些病人中有61%～87%在被诊断为真菌感染时正在应用泼尼松，每日大剂量的泼尼松被认为是可能的危险因素。

新生儿一旦受到新型隐球菌感染，也很容易侵犯中枢神经系统而致脑膜炎，其传染途径可能是当分娩时经过带有该菌的产道而受感染；有某些新生儿出生后便即刻发生症状，这不能不使人考虑到通过胎盘传染的可能性。

易感动物有犬、猫、猪、牛、马、猴、兔、鼠和禽类。

3　致病性

3.1　致病机理

基本病理变化有两种，早期为弥漫性浸润渗出性病变，晚期为肉芽肿形成。早期病变，可以在组织中出现多量的新型隐球菌集聚成团。任何组织均可受累。由于菌体四周包绕胶样荚膜，使菌体与组织没有直接接触，所以组织的炎症反应不明显。但在少数已经失去荚膜的菌体周围，则可出现较明显的炎性细胞浸润。肉芽肿的形成常在感染数月之后出现，包括巨细胞、巨噬细胞及纤维细胞的增生，并有大量淋巴细胞的浸润，个别的可有小型的坏死灶及蜂窝状小空洞形成，脑组织较其他组织更易形成小空洞。隐球菌可出现在巨细胞和巨噬细胞的内外，在渗出性或坏死性病灶中隐球菌数目很多，而在肉芽肿病灶中，则很少发现。

3.2　毒力因子

新生隐球菌用墨汁染色后，在普通的显微镜下可以观察到其特殊的细胞壁外的荚膜结构，经电镜放大后，荚膜主要是由放射状排列的荚膜多糖纤维束构成的细密网状结构。新生隐球菌的荚膜是细胞外层的物理屏障，并且在多种水平调节宿主免疫反应，是研究新生隐球菌致病机理的重要内容。

过去几年，Kwon-Chung等应用经典的遗传学方法鉴定了数个表型特征明显的新生隐球菌毒性因子，如荚膜多糖、黑素、磷脂酶B、尿素酶、甘露糖醇等，其中荚膜多糖是第一个被明确认为与致病力有关的隐球菌毒力因素。

3.2.1　荚膜多糖　荚膜多糖是新生隐球菌主要的毒性因子，在隐球菌病动物模型的研究中，用非特异性的方法产生的无荚膜突变株的毒性要比有荚膜的野生株弱。体外试验表明，无荚膜酵母细胞比产荚膜的菌株或加了多聚糖的无荚膜株更易被吞噬，遗传学研究也支持荚膜的产生与其毒性相关。产生甘露醇，对人中性粒细胞的杀伤较敏感。

3.2.2　黑素　黑素是新生隐球菌经典的毒性因子之一，黑素具有抵抗吞噬的保护作用，它处于菌体细胞壁内表面，黑素主要由酚氧化酶催化产生的。编码酚氧化酶(漆酶)的结构基因CNLAC1的cDNA序列已经测定。由于黑素是一种强的抗氧化剂，因此，在隐球菌抗吞噬作用中，它可能有清除氧自由基对菌体的破坏、抗吞噬细胞的氧化杀菌的作用。

3.3　临床症状

3.3.1　对人的致病性　可表现为中枢神经系统隐球菌病、肺隐球菌病、皮肤黏膜隐球菌病、骨隐球菌病及内脏隐球菌病等。

3.3.2　对动物的致病性　新生隐球菌可在多种哺乳动物宿主中引起感染。自新生隐球菌最早描述以来，人们已应用一系列动物种群研究其致病机理，其中小鼠、豚鼠、大鼠和兔应用最为广泛。

已有报道新型隐球菌会导致奶牛的乳房炎，如果食用污染的生牛奶则会危害公众健康。奶牛新型隐球菌性乳房炎的症状是：乳房淋巴结肿大，乳汁浓稠灰白色；可用病原菌的培养、涂片染色及乳房组织活检对其诊断。一旦确诊应淘汰病牛，勿饮生乳。

4　诊断与检测

根据临床表现中新型隐球菌经常引起的中枢神经系统疾病、肺部疾病、骨组织、皮肤黏膜、内脏等的变化进行诊断。确诊需要进行实验室诊断。

4.1　实验室诊断

4.1.1　病原的分离鉴定　采取脑脊液、痰、脓、尿、粪、血、活体组织及尸体解剖材料等直接涂片，采用常规细胞染色可发现隐球菌，但极易误诊。墨汁染色，可见圆形厚壁孢子，菌体直径约4μm～20 μm，外围有一透光的厚荚膜，厚度约5 μm～7μm，荚膜内的菌体可出芽或不出芽，孢内有一较大的反光颗粒(脂质颗粒，不是孢核)和许多小颗粒，可与白细胞或淋巴细胞相鉴别。

真菌培养仍然是确诊的“金标准”，然而培养的阳性率并不高。在沙堡氏琼脂(Sabouraud agar，SDA)于25 ℃或37℃培养时，2 d～5d即生长出乳白色细菌黏液性菌落，呈不规则圆形，表面有蜡样光泽，以后菌落增厚，颜色由乳白、奶油转桔黄色；咖啡酸玉米琼脂(carffeicacid corn-meal agar，CACA)和油菊籽培养基(Niger seedagar，NSAHKUYFTG)皆可产生褐色菌落；在多巴培养基上可出现肉眼可见的黑素。非致病性隐球菌在37℃不生长。快速鉴定：①37℃生长；②尿素酶阳性；新生隐球菌能够产生尿素酶，常用沙堡弱培养，新生隐球菌产生的尿素酶分解尿素，使培养基变为红色；③咖啡酸变棕色，咖啡酸试验阳性；④生化试验不发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖等。

4.1.2　血清学诊断　血和脑脊液标本隐球菌抗原检测能早期快速诊断，具有重要的临床价值。目前隐球菌血清学检测方法已作为临床常规的诊断方法，主要检测隐球菌的荚膜多糖特异性抗原。方法有乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)和单克隆抗体法，其中乳胶凝集试验最为常用。血清特异性抗隐球菌抗体检测包括放射免疫法和试管凝集试验，是对隐球菌的间接检测方法，对预后判断有一定的临床价值。

血清学诊断对隐球菌病的早期诊断和早期治疗甚为重要。为了提高早期诊断率，血清学方法检测隐球菌荚膜多醣体抗原是早期诊断的主要手段。国内已成功建立了ABC-ELISA法、双夹心ELISA法、免疫放射测定法检测新生隐球菌抗原，具有极高的检测特异性和敏感性。

4.1.3　分子生物学检测　应用DNA探针法和聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)探针等方法，具有高度的特异性。不仅可以特异性地检测出新生隐球菌，不受治疗的影响，而且可以区别变种。可以用于感染早期的诊断。特别是PCR方法敏感性更高，可用于痰液、支气管、肺泡灌洗液及经支气管吸出物的检测。

目前，免疫学分型方法仍是经典的分型方法，一些新的分子生物学技术己经补充了新生隐球菌分型研究方面的不足之处，如运用最广泛的PCR指纹分析技术，该技术最优势的是随机扩增多态性DNA(randomamplified polymorphicDNA，RAPD)指纹技术。PCR指纹技术是随着DNA指纹技术和PCR技术的发展而有机结合的产物，PCR指纹技术克服了传统DNA指纹技术操作繁琐且费时的缺点，同时由于应用较长引物(15bp～17 bp)，比RAPD方法(使用的单引物一般为9 bp～10 bp)重复性好。Wit MD等采用PCR指纹技术对11株不同血清型的新生隐球菌参考菌株进行了DNA多态性分析，结果在种、血清型以及菌株水平上呈现特征性的扩增产物。

5　防治

目前治疗隐球菌病的方法包括原发病的治疗、抗真菌药物治疗、对症治疗、免疫抑制疗法以及手术治疗等。对隐球菌感染的疫苗研究也日益引起重视。

抗真菌药物是对隐球菌病的主要治疗方法。主要有两性霉素B、两性霉素B脂质体、5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)、氟康唑及伊曲康唑。治疗方案尚未统一。但多以两性霉素B为基础，联合其他药物的方案为主。PattersonA等认为治疗隐球菌性脑炎单独应用两性霉素B即可，可以用两性霉素B脂质体替代两性霉素B，以减少两性霉素B的毒副作用；动物试验提示，两性霉素B、5-FC、氟康唑联合用药更好。AntoruadouJ等认为隐球菌目前耐药较少见，但应规范用药；对个别的耐药情况，可以应用体外耐药性试验或动物耐药性模型试验，选择用药。KhachornsakdiS等对AIDS患者所伴有隐球菌病的治疗，常规治疗后再应用氟康唑200 mg/d维持一段时间。治疗原发病对本病的治疗十分重要，如治疗HIV感染、停用糖皮质激素、抗肿瘤药物、抗排斥反应药等，遗憾的是很多情况下难以做到。

6　展望

新生隐球菌作为隐球菌属的重要致病菌，该菌主要感染免疫缺陷的患者，尤其是AIDS病人，引起严重的脑膜炎，病死率高达30%。可侵犯人或动物诸多组织器官，引起严重的隐球菌病，死亡率高达18%～37%，是一种人畜共患的传染病。目前，人们在新生隐球菌致病机制的分子生物学方面进行了较为深入的研究，明确了其毒力因子在菌体致病过程中的主要作用，但是目前在动物感染方面研究很少。

研究新生隐球菌不同的血清型与致病性之间的关系是重要的流行病学研究课题。目前在隐球菌疫苗的开发研究方面已取得了一定进展，一种根据隐球菌荚膜多糖成分甘露聚糖(GXM)合成的疫苗已研制成功，动物试验表明有特异性的保护作用。加强对隐球菌的基础和临床研究，包括毒性因子及有关新药的研究、体外药敏试验与体内效果相关性研究、真菌耐药机制研究、不断优化治疗方案及并发症的防治是我们面临的艰巨任务。