3个产地板蓝根多糖作用的比较研究

摘　要：通过小鼠吞噬试验、脾淋巴细胞增殖试验和最低抑菌与最低杀菌浓度的检测，对不同产地板蓝根多糖功能进行比较研究。结果表明，3个产地板蓝根多糖均使小鼠吞噬能力增强，并协同促进淋巴细胞增殖，具有一定的杀菌和抑菌效果。

关键词：板蓝根；吞噬作用；淋巴细胞增值；杀菌和抑菌作用；多糖

板蓝根为菘篮和草大青的根，或植物马蓝的根茎及主根，具有清热解毒、凉血消疼、利喉消肿之功效，因栽培历史悠久，形成了一些地方繁育居群，由于在其进化过程中遗传发生漂变，不同栽培居群的遗传组成产生了变异。种内变异和生态环境的差异导致了不同产地板蓝根的药材性状、理化特征和有效成分含量的不同。板蓝根的研究主要集中在成分分离及药理和性质上，本试验对不同产地板蓝根多糖进行研究，旨在为板蓝根多糖的开发和利用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　材料

板蓝根多糖(本实验室提取)分别来源于山东菏泽的菘蓝的根、江苏连云港草大青的根、四川绵阳的马蓝的根，用生理盐水配成浓度为2mg/mL。7周龄～10周龄的昆明种雄性健康小鼠40只，购于菏泽医学专科学校动物试验室；健康母鸡1只购于菏泽市养鸡场，在本实验室常规饲养1周。试验菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、支原体和链球菌从当地奶牛场采集，分离鉴定纯化后保存的菌株。

1.2　仪器和试剂

DG- 3022型酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂产品；CO2培养箱，美国Reveo公司生产；75-2A型微量振荡器，上海医用分析仪器厂生产；恒温培养箱，天津市津北真空仪器厂生产；倒置显微镜及照相系统(OlympusIX-50)，重庆光学仪器厂生产；721紫外分光光度计，上海第二仪器厂生产；96孔细胞培养板，德国Nunclon公司生产。DMEM培养基， Gibco公司产品，按说明用二蒸水配制后过滤除菌，分装，4℃保存，用前加100 mL/L小牛血清(杭州四季青生物制品厂)；伴刀豆素球蛋白(ConA)，Sigma公司产品，用DMEM培养液分别配成0.25 mg/mL；LPS， Sigma公司产品，用DMEM培养液分别配成0.25mg/ mL；四甲基偶氮唑蓝(MTT)， Amresco公司产品。用pH 7.4的PBS液配成5 mg/mL的溶液，0.22μm的微孔滤器过滤，避光保存；淋巴细胞分离液，上海恒信化学试剂有限公司产品，批号200012200；裂解液，二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，苏州正兴化工研究院产品。

1.3　方法

1.3.1　巨噬细胞的吞噬试验　取小鼠20只，雌雄各半，随机分为4组：试验组I(菘蓝根多糖)、试验组Ⅱ(草大青根多糖)、试验组Ⅲ(马蓝根多糖)、对照Ⅳ组(生理盐水)。每天对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 组分别腹腔注射0.5 mL浓度为2 mg/mL多糖溶液，连续免疫7d，对照组则注射等量盐水，第8天，腹腔注射1 mL 2%鸡红细胞悬液，分别30 min后颈椎处死小鼠，无菌注射2mL生理盐水到腹腔中揉匀，5 min后取腹腔液，调细胞浓度为2×105个/mL，取300 μL于载玻片上置湿盒内 37℃培养箱中贴附30 min，取出后用37 ℃预热的PBS冲洗未被吞噬的鸡红细胞，立即置甲醇溶液中固定3 min，用吸水纸从玻片边缘吸除大部分甲醇后自然晾干，然后用姬姆萨染液染色20 min，自来水冲洗去多余染液后晾干待观察，计算吞噬率和吞噬指数。

吞噬率百分率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞个数/100个巨噬细胞×100%；吞噬指数＝巨噬细胞吞噬鸡红细胞总数/100个巨噬细胞

1.3.2　淋巴细胞增殖试验　取3只小鼠颈椎处死，无菌取脾脏，用灭菌生理盐水冲洗3次，放入含Hank’s液的平皿中剪碎，装入100目网孔的尼龙网袋中，用弯针头挤压过滤收集细胞液，加入淋巴细胞分离液，2000 r/min离心20min，吸取中间云雾状白细胞层，用Hank’s液洗2次，用MDEM营养液稀释成1×106个/mL的细胞悬液，分别向细胞悬液中加入ConA和LPS(终浓度为5 μg/mL)，然后加入到96孔细胞培养板中每孔100 μL，再分别加入不同地区板蓝根多糖100μL，每个浓度重复4孔。另设ConA和LPS的对照孔，细胞调零孔。将细胞板放入体积分数为5% CO2培养箱中37 ℃培养44h，每孔中加入20 μL MTT液，继续培养4 h取出，各孔吸出上清液，加入100μL裂解液，在微量震荡器上混匀使其颜色变澄清，用酶标仪检测570nm下的吸光度，作为淋巴细胞增殖的指标，OD570＝给药组OD值－空白OD值。

1.3.3　最低抑菌浓度(MIC)测定　按试管2倍稀释法进行。取7支高压灭菌试管，各管分别加入营养肉汤1mL，在第1管中加入试剂浓度为2 mg/mL多糖溶液1 mL，混匀后吸取1 mL加入到第2管中，第2管按同样方法混匀后吸取加入1mL到第3管，依次稀释至第6管，第6管混匀后弃去1mL，第7管不加药液作对照。各管分别加入用生理盐水稀释成含菌量为108cfu/mL的试验菌液，混匀，37 ℃培养24h，摇匀，将各管中的液体用接种环接种于平板培养基中，轻轻将菌液摊开，37 ℃培养20 h，观察结果，无菌生长药液最低浓度为MIC。

1.3.4　最低杀菌浓度(MBC)的检测　测出MIC后，依次从未见细菌生长的各试管培养物中分别吸取0.1mL，接种于不含药的平皿琼脂培养皿中，轻轻摊开菌液，37 ℃培养24h，观察有无细菌生长平皿培养基中，生长的菌落数小于5的药液最低浓度，即为MBC。

1.4　数据分析

试验数据用Spss 1.0软件处理。

2　结果

2.1　不同产地板蓝根多糖对小鼠吞噬功能的影响

从表1可以看出，不同产地的板蓝根多糖与对照相比吞噬百分率和吞噬指数差异均达到显著水平(P<0.05)，不同产地的板蓝根多糖之间有一定差异，马蓝根多糖吞噬百分率显著高于菘蓝根多糖和草大青多糖(P<0.05)，而菘蓝根多糖和草大青多糖之间差异不显著(P>0.05)，对于吞噬指数各多糖间差异不显著(P>0.05)。

表1　小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数

Table 1　Pyagocytic index and phagotrophy percentage of macrophagefor mice

Note：The different letter in same line means significantdifference(P<0.05) .2.2　不同产地板蓝根多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

由表2可知，不同产地的板蓝根多糖和ConA或LPS相互作用对小鼠淋巴细胞增殖具有协同促进作用，特别是马蓝根多糖与菘蓝根和草大青根多糖之间差异显著(P<0.05)，而单独板蓝根之间淋巴细胞增殖无显著差异(P>0.05)，说明板蓝根多糖不能对小鼠淋巴细胞增殖产生直接促进作用。

表2　不同产地多糖对体外小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

Table 2　The effect of different source amylose on the spleenlymphocyte proliferation

Note：The different letter in same line means significantdifference(P<0.05).

2.3　不同产地板蓝根多糖最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)

3个产地的板蓝根多糖对支原体、链球菌、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用。其中菘蓝根和草大青多糖对金黄色葡萄球菌和支原体的抑制作用较强，MIC均为0.125g/mL；对大肠埃希菌和链球菌，药物浓度为0.250 g/mL时有部分抑制作用，其MIC均为0.500g/mL。马蓝根多糖浓度为0.125g/mL时对金黄色葡萄球菌、链球菌有部分抑制作用；对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑制作用较弱，MIC分别为0.500g/mL和0.250 g/mL。

由表4可知，马蓝根多糖在0.125 g/mL时能够完全杀灭大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、支原体和链球菌，草大青根多糖浓度为0.125g/mL时能杀灭支原体和大肠埃希菌，对链球菌、金黄色葡萄球菌的MBC为0.250g/mL；而菘蓝根多糖效果相对较差，对链球菌的MBC为0.5 g/mL。

表3　3种板蓝根多糖最低抑菌浓度

Table 3　The minimum inhibition concentration of threepolysaccharide of Radix isatidis

Table 4　The minimum bacteriostasis concentration of threepolysaccharide of Radix isatidis

板蓝根多糖具有免疫调节作用，对特异性免疫和非特异性免疫均有一定的促进作用，巨噬细胞是机体非特异性免疫的关键细胞，它承担着摄取处理和递呈抗原的重要作用，并直接对靶细胞产生特异性的杀伤作用。巨噬细胞表面有多种介导细胞间相互作用的受体，而多糖能通过多糖受体使巨噬细胞活化，激活的巨噬细胞可以增强淋巴细胞的免疫生物学活性从而达到抗菌消炎、抗内毒素、抗肿瘤以及促进机体免疫中都有重要作用。

细胞增殖试验是测定免疫细胞功能的方法之一，淋巴细胞受到各种因子刺激时会发生细胞增殖。在细胞增殖过程中，细胞的代谢处于旺盛状态。细胞增殖需要大量的能量，以供合成各种大分子物质和完成分裂过程，因此细胞能量代谢的水平往往可以间接反映细胞增殖情况，Mosmann根据这一原理首创了MTT比色分析方法。本试验采用该法测定小鼠体外T、B淋巴细胞的增殖，灵敏可靠。小鼠T淋巴细胞未经ConA刺激时处于Go期(静止期)， ConA可以诱导T淋巴细胞表达IL-2受体，使T淋巴细胞活化；也可以使T淋巴细胞从G0期进入G1期(DNA合成前期)。LPS是B细胞的分裂原，直接刺激B细胞发生有丝分裂为B细胞的多克隆激活剂。据梁中琴等报道，灵芝多糖能刺激人外周血淋巴细胞从G1期进入S期并可使CD4＋细胞数量明显升高，CD4＋/CD8＋细胞比例增加。林志彬等报道灵芝多糖可通过间接激活淋巴细胞中的DNA多聚酶促进DNA合成及T淋巴细胞增殖。本研究试验结果表明，不同产地板蓝根多糖对未经ConA或LPS刺激的静息期细胞没有明显的促增殖作用，然而对ConA活化的小鼠T淋巴细胞能促进增殖，表明两者有协同作用。同样对于LPS激活的B淋巴细胞同样能促进细胞增殖，提示板蓝根多糖对T，B淋巴细胞均具有促进有丝分裂的作用，是一种理想的免疫刺激剂。

支原体、链球菌、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌几乎存在于所有的哺乳动物体内，特别是畜禽类，可以导致各种疾病。本试验证明不同产地的板蓝根多糖都呈现出一定的抗菌和杀菌能力，特别是马蓝根多糖具有较强的抑菌能力和杀菌能力，对于其机理有待进一步研究。