猪圆环病毒2型疫苗研究进展

摘　要：猪圆环病毒2型主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，在包括中国在内的各养猪国家广泛流行，造成严重的经济损失，受到国内外学者的高度重视，对此病的研究特别是对其疫苗的研究正日益受到关注。文章就猪圆环病毒2型的灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗的研究进展做了详细的阐述。

关键词：猪圆环病毒；灭活疫苗；弱毒疫苗；基因工程疫苗

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)是断乳仔猪多系统综合征(Post-weaningmulti-systemic wastingsyndrome，PMWS)的主要病原，自1991年PMWS在北美最先发现以来，已在世界范围内流行。由于PCV-2经常与多种病原混合感染，典型性临床症状有消瘦、皮肤苍白、腹泻、呼吸障碍及轻度的黄疸，还包括神经症状、繁殖障碍、皮炎等。PCV-2及其相关的猪病死亡率10%～30%不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。文章就PCV-2疫苗的研究进展做一综述。

1　PCV灭活疫苗

一种用于经产母猪和初产母猪的含有佐剂的灭活PCV-2疫苗，现在已经在商业上应用，并且在一些欧洲国家获得应用许可。该疫苗对PMWS的防控效果需要进一步确定。对断奶仔猪使用试验性PCV-2灭活疫苗已经显示出临床效果，但仍需进行进一步的试验。

2　弱毒疫苗

Fenaux M等将PCV-2分离株在PK-15细胞中连续传至120代，将第1代病毒(PCV-2VP1)基因与传代病毒比较，发现第120代病毒(PCV-2VP120)基因组中发生了2个碱基突变，并且都位于Cap基因内，第一个突变发生于第30代病毒，该突变使核衣壳蛋白中第110位的脯氨酸变为丙氨酸，并且在以后的传代中一直维持；第二个突变发生于第120代，使Cap蛋白中第191位的精氨酸变为丝氨酸。将PCV-2VP120和PCV-2 VP1感染SPF猪进行比较，发现PCV-2 VP120 感染后的病毒血症发生率低于PCV-2VP1，同时病毒血症的持续时间短，血清中PCV-2基因组拷贝量、眼观病变及组织学病变也较PCV-2VP1感染猪轻，表明体外传代可增强PCV-2在细胞中的增殖能力，弱化其致病性，这为研制PCV-2疫苗提供了一个新的思路。

3　基因工程疫苗

3.1　核酸疫苗

KamstrupS等为了进一步探索衣壳蛋白免疫预防的适用性，采用了pcDNA3.1/V5-His/TOPO真核表达载体克隆了PCV-2的ORF2基因，并证实了此质粒能够在体外(通过直接表达蛋白)以及体内(通过对小鼠用基因枪注射质粒，诱导小鼠免疫产生抗体)进行表达。免疫试验结果表明，所构建的核酸疫苗均能诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫反应。

金宁一等以pVAXⅠ为载体，构建了表达PCV-2 ORF1、ORF2和猪IL-18的核酸疫苗pVAXⅠ-ORF2、pVAXⅠ-IL18-ORF2、pVAXⅠ-ORF2-ORF1、pVAXⅠ-IL18-ORF2-ORF1等。用这些核酸疫苗免疫6周龄～8周龄小鼠，采用ELISA方法检测小鼠血清中的PCV-2抗体，用流式细胞仪检测脾CD4＋、CD8＋T淋巴细胞亚类数量。免疫试验结果表明，所构建的核酸疫苗均能诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫反应，其中核酸疫苗pVAXⅠ-IL18-ORF2-ORF1免疫效果优于其他几种疫苗。

宋云峰等将ORF2 基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(＋)，构建了pC-ORF2作为核酸疫苗免疫小鼠。同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，命名为pCORF2BVP22和CBVP22ORF2。分4组肌肉注射免疫接种Balb/c小鼠，分别注射pCD2NA311(＋)、pCORF2、pCORF2BVP22和pCBVP22ORF2，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，ELISA法检测体液抗体。同时为在体外验证ORF2和BVP22基因的真核表达，将ORF2和BVP22基因分别克隆入pEGFP2N1载体，构建了pNORF2和pNBVP22，转染Hela细胞后在荧光显微镜下观察到了ORF2和BVP22在体外的瞬时高效表达。结果显示，通过两次免疫后，各疫苗组均产生了针对ORF2的体液抗体，同时证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好，为防控猪圆环病毒2型感染提供了较为理想的侯选疫苗。

Blanchard P等研究了PCV-2基因疫苗及亚单位苗的免疫效力，仔猪用ORF2和GM-CSF表达质粒首免，2周后用ORF2和GM-CSF表达质粒以及ORF2蛋白二免，免疫猪可抵抗PCV-2的攻击，表明ORF2可诱导机体产生免疫保护。但通过比较，单独用PCV-2基因疫苗两次免疫的效果低于亚单位苗的效果，不能完全抑制PCV-2的增殖。

3.2　重组疫苗

Zhou J Y等首次在大肠埃希菌中对缺失了核定位信号序列(NLS)的PCV-2Cap蛋白(dCap)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)进行了融合表达，获得了rGST-dCap蛋白，试验证明，纯化的rGST-dCap蛋白以及去掉GST的rdCap蛋白，均可与抗PCV-2猪血清发生特异性反应；用rdCap蛋白制备的单抗，可与感染PK-15细胞的病毒粒子以及在PK-15细胞中表达的Cap蛋白发生反应，同时表现对PCV-2病毒粒子的中和活性。表明rGST-dCap蛋白可以作为潜在的疫苗抗原和血清学诊断试剂。

FenauxM等应用基因工程方法，构建了PCV-1和PCV-2相互嵌合的感染性克隆，对其免疫原性和致病性进行了研究，发现将PCV-2的ORF2基因克隆进PCV-1基因组中，对猪的致病性小于PCV-2基因组，并可诱导机体产生PCV-2核衣壳蛋白抗体，但是对猪的免疫反应性很弱。随后的试验表明，该减毒的PCV1-2嵌合感染性克隆可诱导机体产生免疫保护，抵抗PCV-2野毒株的攻击。用PCV1-2免疫后，攻毒猪的病毒血症发生率、淋巴结肿大、淋巴结中PCV-2基因组拷贝量、PCV-2抗原量、淋巴

组织的病变等方面均显著低于非免疫猪，表明减毒的PCV1-2 嵌合子可诱导机体产生针对PCV-2的保护性免疫反应，有望作为疫苗使用。

3.3　活载体疫苗

Ju C等用减毒的伪狂犬病病毒(PRV)作为活病毒载体，构建了表达PCV-2ORF1-ORF2的重组病毒PRV-PCV-2。试验表明，PRV-PCV-2可诱导小鼠和猪产生强烈的抗PCV-2和PRV抗体反应，在小鼠中产生针对PRV的免疫保护，可抵抗致死量的PRVEa株的攻击，表明PRV-PCV-2可用于抵抗PCV-2和PRV感染。

Song Y等将PCV-2ORF2基因插入pIECMV质粒，与伪狂犬病毒Tk-/gE-/LacZ＋基因组共转染IBRS-2细胞，产生一个重组的Tk-/gE-/ORF2(＋)病毒。Westernblot和IFA检测结果表明PCV-2的ORF2基因得到表达。用该重组病毒免疫4周龄的仔猪，采用PRV-ELISA，PRV中和试验，ORF2-ELISA和ORF2特异性的淋巴细胞增殖试验等方法检测了PRV Tk-/gE-/ORF2(＋)的免疫原性。结果表明，PRVTk-/gE-/ORF2(＋)诱导了明显的抗PRV和PCV-2体液免疫反应，并且在试验的第49天能够检测到PCV-2特异性的淋巴细胞增值反应。上述研究表明重组的PRVTk-/gE-/ORF2(＋)可能作为一个潜在的疫苗来预防PCV-2和PRV。

Wang X W等用表达PCV-2ORF2的重组腺病毒免疫小鼠，结果表明，所构建的重组腺病毒能够表达ORF2蛋白，能够在小鼠体内诱导抗PCV-2免疫反应，对有效预防PCV-2相关疾病的感染，重组腺病毒可能是一个比较理想的载体。

总之，PCV-2的免疫学及疫苗研究取得了很大进步，开发安全有效的PCV-2新型疫苗仍然是今后努力的方向。