摘 要：根据副鸡嗜血杆菌的16 SrDNA基因序列设计一对特异性引物XZIC1和XZIC2，对6株副鸡嗜血杆菌进行PCR扩增。结果显示，该对引物对6株副鸡嗜血杆菌均扩增出与预期大小相一致的282bp片段，而对鸡毒支原体、禽巴氏杆菌、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒(H9)、鸡喉气管炎病毒及葡萄球菌等9种病原体的扩增结果均为阴性。该PCR敏感性结果表明，本方法可以检测到10pg的副鸡嗜血杆菌DNA模板。采用引物XZIC1和XZIC2，对分别用副鸡嗜血杆菌ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269株感染SPF鸡的临床病料DNA进行PCR扩增，均可扩增出单一的282bp的片段。
关键词：PCR；副鸡嗜血杆菌；检测
鸡传染性鼻炎(Infectious coryza， IC)是由副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum，HPG)引起的一种上呼吸道疾病，最明显的症状是鼻道和鼻窦有浆液性或黏液性分泌物流出、面部水肿和结膜炎，肉垂出现明显肿胀。该菌有A、B、C3个血清型，主要引起育成鸡生长不良，产蛋鸡产蛋率下降，给养鸡业造成很大的经济损失。目前诊断鸡传染性鼻炎的方法主要用传统的细菌培养和生化鉴定副鸡嗜血杆菌，由于副鸡嗜血杆菌对营养要求高，不易培养，而且该菌常常与其它细菌混合感染，无法快速鉴别诊断，因此应用特异、快速、敏感的聚合酶链反应(PCR)检测副鸡嗜血杆菌技术就显得非常重要。据报道陈小玲等用鸟枪法建立的HPG基因文库，建立了HPG的PCR诊断方法，宋敏训等利用aroA基因建立鸡传染性鼻炎PCR诊断方法，在国内末见应用16S rDNA基因PCR检测诊断鸡传染性鼻炎的报道，本试验根据副鸡嗜血杆菌高度保守的16 S rDNA基因建立了PCR检测方法。
1 材料与方法
1.1 菌株
副鸡嗜血杆菌(ctcc253、ctcc255、ctcc256、ctcc257、ctcc258、ctcc269)由中国国家兽医微生物菌种保藏管理中心购买。鸡毒支原体(MG-S6)、禽巴氏杆菌(C48-1)、鸡传染性支气炎病毒(H120)、鸡新城疫病毒(NDV-LaSota)、大肠埃希菌(O57)、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒(H9)、喉气管炎病毒(ILTV)及葡萄球菌由本研究室保存。
1.2 试剂与仪器
PCR试剂盒、克隆载体pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司，100 bp DNALadder购自北京天为时代科技有限公司，DNA片断回收试剂盒购自BioDev公司，PCR仪购自美国Perkin ElmerCetus公司。
1.3 引物设计与合成
根据副鸡嗜血杆菌的16 SrDNA基因，设计一对引物XZIC1和XZIC2，并通过Blast验证，该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，经高效簿层色谱法纯化，为冻干品，用前用适量的灭菌超纯水溶解，参照Sambrook方法测其浓度，并分装成20μL/管，置－20 ℃保存备用。引物序列如下：
XZIC1：5′-CCGCATAGAATCGGAAGA-3′
XZIC2：5′-CCAACCTTCCTCACCACC-3′
1.4 副鸡嗜血杆菌病原培养物收获及处理
将副鸡嗜血杆菌病原菌种接种于副鸡嗜血杆菌培养基，经37 ℃培养24 h后，取培养物1.5 mL，于4 ℃ 12 000r/min离心15 min，弃去上清液。用1 mL PBS悬浮沉淀物，以相同速度离心洗涤2次，弃去上清液。用650 μLTE缓冲液悬浮沉淀。供副鸡嗜血杆菌总DNA抽提，或者于－20 ℃保存备用。
1.5 临床组织病料的采集及预处理
无菌采取200 mg待检鸡的喉气管、眶下窦组织，置于乳钵或玻璃研磨器中，加入无菌的PBS充分研磨，收集组织悬液于1.5mL离心管，以650 r/min离心5 min，收集上清液。用灭菌棉拭子取待检鸡眶下窦、喉头、腭裂的分泌物，浸泡于1 mLPBS中，室温放置30 min，洗脱棉拭子上黏附的分泌物，弃去棉拭子，留上清液。将上述上清液在12 000r/min离心15 min，倒去上清液。用650 μL TE缓冲液悬浮沉淀。供副鸡嗜血杆菌总DNA抽提，或者于－20 ℃保存备用。
1.6 核酸抽提
参照文献抽提其核酸DNA，即取经预处理的650 μL待检样品，然后加入1/10体积的100 g/L SDS溶液，10μL蛋白酶K(20 μg/mL)和6 μL RNase酶溶液(10 μg/mL),37 ℃作用1h，用等体积的酚与氯仿(1∶1)和氯仿与异戊醇(24∶1)分别抽提1次，然后10 000 r/min离心5min，取其上清加入1/10体积3 mol/L NaAc和2倍体积的无水乙醇，于－20 ℃作用过夜，在4 ℃以10 000r/min离心15 min，弃上清，用750mL/L乙醇洗涤1次，稍干燥，沉淀核酸加入适量的TE溶解。参照Sambrook方法测定核酸的浓度和纯度，保存于－20℃备用。对照菌(毒)株的DNA的抽提则按文献方法进行。
1.7 PCR扩增
100 μL的反应体系中，含25 mmol/L MgCl2 5 μL，10×PCR buffer 10 μL， 10 mmol/LdNTPx 2 μL，Taq聚合酶0.5 μL，适当浓度的上游引物和下游引物各5 μL，模板5 μL。
1.8 PCR各反应条件的优化
以副鸡嗜血杆菌ctcc253株培养物抽提的DNA为模板，对PCR各循环参数和各引物浓度等进行优化，以确定最佳的PCR条件。
1.9 PCR特异性试验
将已提取的ctcc253、ctcc255、ctcc256、ctcc257、ctcc258、ctcc269株的DNA以及对照菌(毒)株的DNA分别加入到含有XZIC1、XZIC2引物的PCR反应体系中进行扩增，检测其特异性。
1.10 PCR的敏感性
测定副鸡嗜血杆菌ctcc253株模板的DNA含量后，按10倍递增稀释，同时加入到最佳的PCR反应体系中进行扩增，检测其敏感性。
1.11 PCR产物的电泳分析及克隆测序
取10 μL PCR产物分别与3 μL溴酚兰混合，在10g/L琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察拍照，与DNA标准分子量作比较，分析并记录结果。在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用凝胶回收试剂盒纯化回收。取适量纯化回收的PCR产物，与质粒载体pMD18-T于16℃连接过夜，转化DH5α大肠埃希菌。挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的白色菌落，37℃培养，用碱裂解法抽提质粒进行PCR快速鉴定，阳性克隆质粒菌送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
2 结果
2.1 PCR条件优化
通过对PCR的引物浓度、各反应温度、时间及循环次数等进行优化，最后确定PCR中引物XZIC1、XZIC2的最佳工作浓度分别为300ng；PCR的最佳反应条件为94 ℃ 5 min，然后94℃ 1 min，55 ℃ 1 min,72℃ 1min，共进行35个循环，最后72 ℃ 10 min后，4 ℃结束反应。
2.2 PCR特异性扩增结果
对ctcc253、ctcc255、ctcc256、ctcc257、ctcc258、ctcc269及对照菌毒株核酸进行PCR扩增，结果副鸡嗜血杆菌株扩增出282bp条带，而其他对照菌(毒)株均未出现任何扩增条带(图1)。
1.DNA标准DL 2000；2.ctcc253；3.ctcc255；4.ctcc256；5.ctcc257；6.ctcc258；7.ctcc269；8.鸡毒支原体；9.禽巴氏杆菌；10.传染性支气炎病毒；11.鸡新城疫病毒；12.大肠埃希菌；13.鸡白痢沙门菌；14.禽流感病毒(H9)；15.喉气管炎病毒；16.葡萄球菌
1.DNA Marker DL 2000；2.ctcc253；3.ctcc255；4.ctcc256；5.ctcc257；6.ctcc258；7.ctcc269；8.Mycoplasmagallisepitcum；9.Avian Pasteurlla multocida；10.Infectious bronchitisvirus；11.Newcastle disease virus；12.Escherichia coli；13.Salmonellapulloru；14.Avian influenza (H9)；15.Infectious laryngotracheitisvirus；16.Staphylococcus
图1 副鸡嗜血杆菌PCR的特异性试验
Fig.1 The specificity test of HPG PCR
2.3 PCR的敏感性测定结果
经过敏感性测定， PCR最低能检出10 pg副鸡嗜血杆菌ctcc253株DNA模板(图2)。
1.DNA Marker DL 2 000；2.100 ng；3.10 ng；4.1 ng；5.100 pg；6.10 pg；7.1pg；8.100 fg
图2 副鸡嗜血杆菌PCR的敏感性试验
Fig.2 The sensitivity test of HPG PCR
2.4 测序结果与序列分析
经测序与序列Blast比对分析，证明了PCR扩增产物与设计大小 (282 bp)相符， PCR产物的核酸序列与引物设计模板16 SrDNA基因对应片段的同源性为100%。
1.DNA标准DL 2000；2～5.ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269感染SPF鸡的眶下窦、喉气管；6～9：ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269感染SPF鸡的咽喉棉拭子；10.阳性对照
1.DNA Marker DL 2 000；2-5.ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269inffraobital sinuses and tracheas of experimental infected SPFchicken withctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269；6-9.ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269throat swabs of experimental infected SPF chicken withctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269；10.Positive control
图3 PCR检测副鸡嗜血杆菌人工感染SPF鸡临床样品的结果
Fig.3 Detection of HPG in SPF chicks artificially infected with HPGby PCR
2.5 临床样品的PCR检测结果
采用引物XZIC1、XZIC2，对分别用副鸡嗜血杆菌ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269株感染SPF鸡的临床病料(咽喉棉拭子、眶下窦、喉气管)抽提的总DNA进行PCR扩增，结果只扩增出282bp的条带。
3 讨论
本试验设计针对副鸡嗜血杆菌株16 SrDNA基因序列保守区域的一对引物，对副鸡嗜血杆菌株进行PCR扩增，结果均能扩增出与设计大小相符的282bp条带，该片断测序结果与原参照序列基因组一致，而该PCR对其他9种病原体均不能扩增出任何条带，说明本研究设计的引物对副鸡嗜血杆菌株DNA的扩增是特异的。该PCR的敏感性最低可检测到10pg的副鸡嗜血杆菌株总DNA，如此高的特异性和敏感性，提示该技术不但可以用于对该病的诊断，也可用于表面健康的带毒鸡的检疫和感染初期或潜伏期的鸡传染性鼻炎鸡的检测及环境监测。该方法对有效治疗和控制鸡传染性鼻炎病，防止该病暴发，给人们提供高质量的鸡产品，具有重要的意义。
用本试验建立的PCR检测了人工感染副鸡嗜血杆菌鸡的棉拭子样品及鸡的眶下窦、喉气管组织病料，结果与副鸡嗜血杆菌分离试验完全一致，因此该方法可以替代常规的细菌学检验。而常规细菌分离鉴定需要10d以上，本试验建立的PCR检测副鸡嗜血杆菌的技术，在数小时内就可检测出副鸡嗜血杆菌株，不仅具有很好的特异性和极高的敏感性及重复性，且具有简便、快速和易于自动化的特点。这对鸡传染性鼻炎的有效控制和流行病学研究有十分重要的实用价值。
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