口蹄疫转基因植物可饲疫苗研究进展

摘　要：口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性热性高度接触性传染病，给畜牧业造成极大的经济损失，疫苗是预防和控制该病的有效方法。近年来，转基因植物可饲疫苗由于其易于生产、成本低廉、使用方便和安全等诸多的优点成为口蹄疫新型疫苗的研究热点。文章综述了口蹄疫转基因植物可饲疫苗的研究现状，介绍了其原理和方法，分析了其优缺点和改进方法，并对其应用前景进行了展望。

关键词：口蹄疫；转基因植物；可饲疫苗

目前，世界上主要应用灭活疫苗来控制口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)，然而，用完整病毒粒子灭活疫苗控制FMD所引起的免疫保护具有血清型局限性，保护期短，且需要多次免疫。而且灭活苗中可能存在灭活不完全的病毒粒子而成为新的疫源。随着转基因技术日臻成熟，应用转基因植物制备口蹄疫疫苗的研究取得了可喜的进展，现就近年FMD转基因植物可饲疫苗的研究进展进行综述。

1　研究背景

转基因植物技术突破了传统育种技术的局限，创造出许多具有抗逆、抗虫、高产、耐盐等优良性状的全新品种，被誉为第二次“绿色革命”。随着基因工程的发展，人们开始利用植物来生产药物和疫苗。1990年，Curtiss等首次在转基因烟草中表达出约占烟草蛋白0.02%的变异链球菌表面蛋白，但没有对其免疫原性作进一步的报道。MasonHS等提出了利用转基因植物生产可饲疫苗的概念。随后的研究认为转基因植物疫苗对预防和消除某些疾病有广阔的应用前景。利用转基因植物生产疫苗已受到高度重视，是当前新型疫苗研究的热点之一。

2　利用转基因植物生产可饲疫苗的原理和方法

生产口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus，FMDV)转基因可饲疫苗首先是分离要转化的目的基因，通过酶切、筛选得到重组质粒，进而构建表达载体并以一定的转化方法转入植物基因组中。目前，主要有载体介导法、基因枪法和花粉管通道法等3种方法。其中载体介导法是最常用的方法，他有两种类型：由农杆菌(Agrobacterium)T-DNA载体介导与植物基因组整合的稳定表达，其优点是能产生大量的转基因植物后代，能够产生多基因复合疫苗产品，通过选择调控元件使得外源基因能在特定的组织、器官中表达；以病毒为载体的瞬时表达，将抗原决定簇与植物病毒衣壳蛋白基因溶合，常用的植物病毒有烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus，TMV)、豇豆花叶病毒(Cowpea mosaicvirus，CPMV)、椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)、马铃薯X病毒(Potato Xvirus，PXV)等，其优点是外源基因的表达量高。转基因载体的构建对植物基因工程来说也是十分重要的。构建载体时，需选择合适的调控元件以提高外源基因转录和翻译的水平，提高外源基因的表达量；还需选择有效的抗性基因和报告基因，以便筛选和检测转化株。

3　用于转基因植物可饲疫苗的FMDV基因

FMDV属于小RNA 病毒科(Picornavirdae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的成员，其基因组为单股正链RNA，约由8 500个核苷酸组成。基因组的基本结构是：VPg-5′UTR(S-polyC-IRES)-L蛋白-结构蛋白P1(VP4-VP2-VP3-VP1)-非结构蛋白P2(2A2B2C)-非结构蛋白P3-3′UTR-poly(A)。目前用作转基因植物的FMDV基因主要是结构蛋白基因VP1、P1及非结构蛋白基因2A、3C。VP1 基因编码的蛋白位于病毒衣壳的表面，可诱导机体产生中和抗体。P1基因编码口蹄疫的4种主要结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)，构成了病毒的抗原位点。P1上的抗原位点随病毒血清型的不同而有所不同，O型FMDV至少有5个中和性抗原位点：抗原位点1由VP1G-H环(1 133～1157)和C端200位～213位氨基酸的线性表位组成，是FMDV最重要的抗原位点；抗原位点2位于病毒表面VP2的βB-C环和βE-αB上；抗原位点3位于病毒粒子表面五重轴周围VP1的βB-C环上；抗原位点4在VP3的βB结构上；抗原位点5位于VP1的G-H环内。2A基因编码的蛋白能够自我催化P1-2A同2C的解离；3C基因编码的蛋白是病毒成熟过程中重要的蛋白酶之一，由它催化多聚蛋白的次级裂解。将FMDV P12A 基因和3C基因联合在植物中表达，蛋白酶3C 可专一性地裂解P1 产生VP0、VP3和VP4等成熟蛋白，它们进一步装配成的空衣壳可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫。

4　研究概况

4.1　转基因豇豆

UshaR等构建了CPMV两个基因组RNA的全长cDNA克隆，并将口蹄疫病毒VP1基因成功地插入S衣壳蛋白基因编码区中，重组质粒转录RNA，并用其以机械方式接种于豇豆植株。10d后，接种过的植株显示与被野生型CPMV侵染植株不同的性状。接种植株的叶提取物的电镜检测显示，存在聚集的CPMV状颗粒。从被侵染的叶组织纯化出杂合的病毒粒子的Westernblot分析表明，其保留了FMDV专一性环。通过鉴定CPMV的分子结构，确定插入外源表位的正确位置，使插入结构中的环暴露于病毒粒子表面，从而可被迅速识别确保发生强免疫反应。他们用这种杂合病毒粒子制备了用于豚鼠的实验疫苗并进行了免疫试验。结果显示，能诱导豚鼠产生特异性免疫应答。转基因豇豆表达的FMDV表面抗原能被FMDV阳性血清识别。

4.2　转基因苜蓿

Wigdorovitz A等用表达FMDVVP1的转基因苜蓿口服免疫或非经肠道免疫小鼠产生了相似的病毒特异性免疫反应，用FMDV强毒进行攻毒试验，小鼠得到了完全的保护。但转基因植物的表达量低是限制其应用的一个重要因素。为了提高其表达量，DusSantos M J等用转基因苜蓿表达了FMDVVP1上135位～160位的氨基酸与DUS融合基因，表达量得到了显著的提高。用表达的融合蛋白免疫小鼠，产生了针对FMDVVP1上135位～160位的合成多肽、结构蛋白VP1以及完整病毒粒子的特异性抗体，并可保护小鼠抵抗病毒的攻击。随后，DusSantos M J等又用表达FMDVP1全长和3C蛋白酶的转基因苜蓿，非经肠道免疫小鼠产生了免疫反应，用FMDV强毒进行攻毒试验，小鼠保护率可达100%。

4.3　转基因烟草

Wigdororiz A等将FMD结构蛋白VP1基因成功地插入到TMV lJ1基因组中或置于CaMV35S启动子控制下，重组的TMV和双元载体pRoK1VPIa接种本塞姆氏烟草(Nicotianabenthamiana)。Western blot分析表明，接种4 d后就可以在叶子提取物中检测出VP1蛋白，接种后7d达到其含量的最高峰，粗略估计每克新鲜叶子中含有VP1结构蛋白50 μg～150μg。用叶子提取物对豚鼠进行免疫学试验，结果显示能诱导动物产生特异性免疫应答 。经攻毒试验，小鼠得到了完全的保护。LiY等构建烟草叶绿体表达载体pTRVP1，通过基因枪法转入烟草叶绿体基因组中，免疫印迹和酶联免疫定量检测表明，VP1基因在烟草叶绿体中得到表达，占可溶性总蛋白的2%～3%，表明植物叶绿体是一个高效表达重组抗原的表达系统。HuangY等 将VP1 G-H环(140位～160位)的21 个氨基酸(VP21)抗原插入到乙型肝炎病毒核心抗原(HepatitisB coreantigen，HBcAg)基因内部，构建植物表达载体pBI121，然后转化烟草，免疫显微观察表明，重组融合蛋白HBcVP1在转基因烟草叶片中能形成一种病毒样颗粒(超低板)的结构。用叶子提取物对小鼠进行腹腔接种免疫，发现产生抗HBcAg和口蹄疫病毒VP1的特异性抗体。攻毒后免疫小鼠能得到高度保护。

4.4　转基因拟南芥

1998年，CarrilloC等将口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因插入拟南芥双元载体pRokl，构建重组pRoklVP1，使该基因在拟南芥中表达。经试验证实，其产生的子代植株中含有VP1基因，将转基因拟南芥的提取物0.5mL与适量弗氏不完全佐剂混合。分别于第1天、21天和35天腹膜注射60日龄～90日龄Balb/c雄性小鼠，在最后一次注射后10d检测，发现试验鼠血清特异性抗体水平升高，经口蹄疫强毒攻击后，用表达了VP1的转基因植物提取物免疫的14只小鼠全部得到保护。这是用转基因植物表达病毒抗原免疫动物后获得全部保护的第一篇报道。

4.5　转基因马铃薯

Carrillo C等利用CaMV35S单/双启动子在马铃薯中成功地表达了口蹄疫病毒VP1基因，免疫动物后能引起特异性抗体应答并能保护动物抵抗强毒的攻击，并证明不同启动子在马铃薯中的表达水平没有明显差异。李昌等应用基因枪法将携带有FMDVP1 全长基因的质粒pBI131SP1 导入马铃薯茎段，通过在抗性培养基上严格筛选，获得了马铃薯再生植株。PCR检测及PCR-Southern 杂交分析表明，已成功地将目的基因导入马铃薯基因组中。李昌等又将自主克隆的FMDV P1全长基因构建到植物表达栽体pB1131上，通过农杆菌介导法转入马铃薯，经PCR 及Southern 杂交等方法，证明P1基因已整合到马铃薯染色体基因组中，为进一步利用转基因植物生产FMD疫苗奠定了基础。申慧峰以马铃薯块茎特异性表达启动子patatin 构建了口蹄疫病毒表面抗原融合霍乱毒素B亚基 (Choleratoxin B subunit，CTB)蛋白编码基因CTB-VPl 的植物双元表达载体pBICVP，以农杆菌介导转化马铃薯，获得PCR检测的转基因植株。He DM等通过构建表达载体pBI121CTB-VPl，农杆菌介导转化马铃薯，得到了能稳定表达CTB-VPl的融合蛋白并具有免疫反应原性。

4.6　转基因玉米

余云舟等在构建口蹄疫病毒结构蛋白P1基因植物双元表达载体(pBI131SP1、pBI21P1和pBI121AP1)的基础上，以玉米自交系8902、340、4112的Ⅱ型胚性愈伤组织为受体，用农杆菌介导法和基因枪轰击法转化玉米，获得31株抗性再生植株。GUS染色证明外源目的基因在玉米细胞和组织中得到了表达。PCR 检测、Southern blot 鉴定证实目的基因P1已整合到再生植株的基因组中，共获得了13 株转基因玉米植株，首次进行了FMDV 抗原基因转化玉米的研究。

4.7　转基因胡萝卜

李文建等通过农杆菌介导的遗传转化，以O 型和A 型口蹄疫抗原决定簇基因O21-O14-A21转化胡萝卜。通过筛选，获得潮霉素抗性愈伤组织，经胚状体再生得到156 棵抗性苗。通过GUS 染色检测，GUS报告基因在部分转化的愈伤组织中瞬时表达，并在部分抗性苗中稳定表达。对部分抗性植株进行PCR 和PCR-Southern杂交检测，证实目的基因已经成功整合到胡萝卜基因组中。张娅等将FMDV 结构蛋白VP1 基因的活性肽片段(包括2个141位～160位肽和1个200位～213位肽的基因片段)导入胡萝卜愈伤组织细胞。经PCR 和PCR-Southern杂交等方法鉴定转化苗，确认口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因已整合到胡萝卜染色体中， 转化效率达到52%。SDS-PAGE 试验结果显示，在转化苗总蛋白中有目的基因表达， 胡萝卜种子中可溶性蛋白含量最高，达3.57 g/L，而根中可溶性蛋白含量最低，仅有0.17g/L，靠近心叶的叶片可溶性蛋白含量可达到1.475 g/L，而最外部叶片可溶性蛋白含量仅有0.37 g/L， 相差近5倍。ELISA 检测结果表明， 转化苗中表达的口蹄疫病毒结构蛋白VP1 可以与FMD灭活疫苗免疫动物制备的抗体特异性结合。

4.8　转基因百脉根

王炜等以豆科牧草百脉根为转化受体，将口蹄疫病毒P12A-3C基因通过根癌农杆菌介导法导入百脉根基因组，获得了转基因抗性植株。对转基因植株进行PCR、RT-PCR检测表明，外源基因整合进了植物染色体基因组，并且具有转录活性，通过ELISA 检测到了转基因植株表达的外源目的蛋白。

4.9　转基因水稻

水稻的种植面积广且产量高，重组蛋白水平较高，种子易于贮存。为了获得转基因水稻，倪志华等将O型和A型口蹄疫的抗原决定簇融合基因O21-O14-A21-HBcAg通过农杆菌介导法转入粳稻品种日本晴中。再生植株根和叶片经组织化学染色检测到GUS基因的表达，PCR、斑点杂交及Southern杂交证实了外源基因已整合到日本晴基因组中。通过RT-PCR检测，基因能正常转录。

4.10　转基因蕃茄

潘丽等构建克隆有O 型口蹄疫病毒China99 株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶，经卡那霉素抗性筛选，获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR 检测目的基因的整合与转录，ELISA筛选约40%的卡那霉素抗性植株阳性，分别提取两株经ELISA 和Westernblot检测为阳性的转基因番茄叶片蛋白与弗氏佐剂乳化，于0、15、30 d 经肌肉途径免疫接种豚鼠，第3次免疫后28 d 用100ID50的同源强毒攻击，根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行转基因植物疫苗免疫原性的评估。结果表明，双元表达载体pBin438-VP1构建正确，PCR 、RT-PCR 结果证实口蹄疫病毒VP1 基因已整合到番茄基因组并在转录水平表达，ELISA 和Westernblot 检测重组蛋白能够与FMDV 阳性血清反应。转基因番茄第3次免疫豚鼠后21 d血清效价最高可达1∶64，攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80 %和40 %，证明转基因番茄表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性。随后，为了提高保护率，其又构建了pBin438/P1-2A3C载体，获得了表达P1-2A3C的转基因番茄，用叶的提取物免疫豚鼠，攻毒后保护率可达100%。

5　口蹄疫转基因植物可饲疫苗的优点、不足及技术改进

5.1　可饲疫苗的优点

与常规疫苗相比较，转基因植物疫苗具有独特的优势。使用安全，没有其他病原污染。目前世界上使用的疫苗仍是以口蹄疫弱毒苗和灭活苗为主，尽管这些疫苗是预防口蹄疫的有效工具，但在生产的同时，存在着灭活不完全或弱毒返祖从而传播口蹄疫病毒的潜在危险。可饲疫苗可直接饲用免疫，使用方便。将转基因植物直接饲喂动物，避免了繁琐的免疫程序及注苗时的过敏反应，易于推广。成本低廉，易大规模生产。植物能对蛋白质进行准确的翻译后加工修饰，使三维空间结构更趋于天然状态，表达的抗原与动物病毒抗原有相似的免疫原性和生物活性。投递于胃肠道黏膜表面，能诱导产生特异的黏膜免疫。传统的非经肠道疫苗几乎不能产生特异的黏膜免疫。

5.2　可饲疫苗的不足及技术改进

第一，外源基因在植物中表达量较低。这是转基因可饲植物疫苗研究的最大障碍，尤其是免疫原性较弱的抗原，低表达量的转基因植物难以被直接饲用而达到预防疾病的目的。为在植物中获得较高的表达水平，在进行遗传操作时应考虑下列因素：选用合适的强启动子(如花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子，该启动子在大多数植物细胞内都能启动外源基因的表达)和增强子；优化起始密码周边序列；根据物种对密码子的偏好进行改造和优化；去除不稳定的RNA序列；选择适当的植物表达载体和可增加表达的植物器官转染；应用定位信号，促进蛋白的积累等。

第二，转基因植物可饲疫苗的免疫原性弱。目前，多数可饲疫苗的免疫抗体水平和保护率低，显然作为可饲疫苗是不理想的。为了增强抗原蛋白的免疫原性，可实行免疫原基因与大肠埃希菌热敏肠毒素B亚基(Heat-labileenterotoxin subunitB，LTB)或霍乱毒素B亚基黏膜佐剂基因融合表达；构建多基因表达载体来表达多种免疫原蛋白；另外，蛋白质在植物细胞中的折叠、糖基化、蛋白质裂解等过程需进一步研究。高等植物对蛋白质的折叠和组装过程已被证明同哺乳动物很相似，但植物与动物细胞间蛋白糖基化的不同是一个需要认真解决的问题，对于大多数糖蛋白，正确的糖基化是发挥其生物活性必不可少的，植物糖基化模式与动物糖基化模式的不同是否会影响其抗原结合性、特异性或过敏性，目前还未见详细报道，有待进一步研究。

第三，口服时抗原的消化降解。重组蛋白在经历胃肠消化酶的作用后，可能发生降解或破坏，从而影响其免疫原性。为了防止口服时被消化降解，可使用保护植物蛋白免受降解的佐剂或在抗原基因附近加上一些修饰基因或吸附基因序列来保护口服疫苗不被迅速消化，从而可长时间停留在消化系统内。

第四，免疫耐受。FMDV 可饲疫苗是否会出现免疫耐受以及重组VP1蛋白的理化性质和生物活性与动物和细菌来源的蛋白之间是否存在一定差异，目前尚无定论。Arntzen等认为，饲用植物疫苗抗原只要是模仿病原因子(病毒样颗粒或毒素等) ，就不会引起免疫耐受，但仍有必要进行仔细研究。

第五，蛋白的提纯。植物外源蛋白的提取和纯化技术到目前为止还停留在实验室阶段，如何进行重组蛋白大规模的提取与纯化还需要进一步研究。融合表达一方面可提高外源蛋白的表达量，另一方面可简化蛋白的提取和纯化过程，是解决蛋白提纯的一条有意义的途径。

6　展望

采用转基因植物作为生物反应器生产口蹄疫可饲疫苗具有诱人的应用前景和潜在的社会经济效益。虽然表达抗原的量低而且在免疫效果上与常规灭活疫苗有一定的差距，但随着分子生物学研究的不断深入，新技术的不断涌现和机理的阐明，它完全能够开辟一个生产口蹄疫廉价疫苗的全新领域。