在药品质控、研究、临床应用及生产中,均要对药物的质量进行分析评估。HPLC法是常用的分析方法之一。在其分析检测时,鉴于有些药物缺少适宜的光化学结构,因此不能用常用的光学检测器如紫外、荧光等检测,红外检测器灵敏度较低,不适用于梯度洗脱时应用;质谱检测器,其价格过高,又限制了它的应用;而蒸发光散射检测器(ELSD)则是理想的选择。
ELSD能克服上述检测器中提到的不足,它是适用型检测器,其响应值与样品的质量成正比关系,而与有无光吸收无关,同时流动相在检测前已蒸发,因此在梯度洗脱中EISD的基线是稳定的。
本文主要介绍应用ELSD检测药物的实例,由此可见其优越性。
1 仪器及试剂
Alltech 525二元泵;570自动进样器,Rheadyne,7725i进样阀,蒸发光散射检测器,PE Turbo chrom数据处理软件或HP化学工作站。
溶剂,色谱纯,购自Burdich and jachson公司。
银杏内酯、抗生素及抗凝剂标准品购自Sigma公司,银杏苦内酯由Eneymatic Therapy公司提供,维库溴铵(万可松)、罗库溴铵(爱可松)荷兰,哌库溴铵(阿端)匈牙利,泮库溴铵(潘可龙)意大利。
2 结果与讨论
HPLC的折光检测器,是通用型检测器,但其灵敏度低,且不适于梯度洗脱中应用,同时其随温度的变化而引起基线不稳,此外,最初出来的大溶剂峰,有可能与较早洗脱出的组分峰相重叠。而蒸发光散射检测器,由于流动相在检测前即已蒸发,因此提高了其基线的不稳定性,也提高了灵敏度。
荧光检测器是非常灵敏的检测器,但仅限于有荧光的化合物检测,或经衍生化产生荧光后才能检测。ELSD检测器则直接检测。图1是蒸发光散射检测器检测的两组抗生素HPLC图谱。其中,大环内酯类抗生素的检测条件为:柱:MacrosphereTM300 C4,250 mm×4.6 mm,7 μm;流动相:Acetonitrile:0.2 mol.L-1 Ammonium Acetate in Water,pH 4.5(95∶5);流速:1.0 mL.min-1;检测器:500 ELSD。氨基糖类抗生素的检测条件为:柱:AlltimaTM C18,150 mm×4.6 mm,5 μm;流动相:A:0.2% Pentafluoropropionic Acid B:Methanol;梯度:Time: 0 10,%B: 45 65;流速:1.0 mL.min-1;检测器:500 ELSD with LTATM。传统的检测方法是要经柱前[2]或柱后[3,4]衍生化后用荧光检测器检测的。
紫外检测器主要缺点是对没有紫外吸收的化合物不适用,如其一定用此检测,也需经衍生化。而用ELSD检测器,而可直接将其检测,图2是两种无紫外吸收的植物药成分的ELSD检测图谱。其中银杏内酯的检测条件为:柱:Nucleosil C18,250 mm×2.1 mm,5 μm;流动相:Water:Methanol:Tetrahydrofuran(70∶20∶10);流速:0.2 mL.min-1;检测器:500 ELSD。
人参皂苷的检测条件为:柱:Partisil ODS?,250 mm×4.6 mm,5 μm;流动相:A:Water B:Acetonitrile;梯度:Time:0 30,%B: 20 60;流速:0.8 mL.min-1;检测器:500ELSD。
对只有紫外未吸收的化合物,则用紫外检测时往往灵敏度低,基线易漂移,如采用梯度洗脱则会受到溶剂干扰,图3是用ELSD等UV(205 nm)两种方法检则肌肉松弛剂的比较HPLC图谱,检测条件为:柱:Adsorbosphere UHS C18,150 mm×2.1 mm,5 μm;流动相:A:0.1% TFA in Water B:0.1% TFA in Methanol;梯度:Time: 0 2 12 15,%B: 35 35 57 57;流速:0.2 mL.min-1。由于ELSD的检测前,流动相已蒸发,结果基线稳定。
用紫外检测器,检测未知成分时,由于不了解吸收与质量之间具体关系,因此对此类成分,ELSD能反映也响应与质量之间关系。如图4所示,分别用紫外检测(220 nm)与ELSD/LTA检测,4种抗惊厥药(0.25 mg.mL-1)的HPLC图谱,检测条件为:柱:Platinum EPS C18,150mm×4.6mm,5μm;流动相:A:0.025mol.L-1 Ammonium Acetate,pH 5.5∶Acetonitrile(70∶30);流速:1.5 mL.min-1。由于各化合物摩尔吸光系数不同,其在紫外220 nm波长处的响应值也不同,而ELSD/LTA检测此4个化合物的响应值几乎一样,因此能反应其实际质量。
3 结论
随着医药工业的发展及竞争加剧,对药物成分、代谢产生、降解物与杂质的定性、定量提出了更高的要求,ELSD的应用,则使复杂的药物分析变得简单化了,而且能符合标准的要求。
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