生物碱提取与纯化技术应用进展

生物碱是许多中药的有效成分，提取与纯化是生物碱制备的关键环节。目前较为常用的提取方法有煎煮、浸渍、回流和渗漉；纯化方法有有机溶剂萃取、色谱和树脂吸附。超声、微波辅助提取、超临界流体萃取、分子印迹和膜分离等技术的应用使生物碱制备向高效节能方向发展。本文综述了生物碱制备常用的提取与纯化工艺与新技术的应用进展，分析了它们的原理及优缺点并探讨了发展前景。
关键词：生物碱；提取；纯化

生物碱（alkaloid）是指中药中一类含氮杂环的有机物，具有碱性和显著的生理活性。目前从植物中分离出的生物碱有五六千种，一些生物碱因其抗癌抗肿瘤及低毒性、低成本成为近年来研究的热点。科学高效地从中药植物中提取、纯化其中的生物碱成分是提高中药质量的核心问题，因此生物碱提取与纯化技术成为人们关注的焦点。
生物碱的溶解性能是提取与纯化的重要依据。生物碱及其盐类的溶解度与生物碱分子中氮原子的存在形式、极性基团的有无及数目、溶剂种类都有密切关系。按生物碱在不同极性溶剂中的溶解能力可分为亲脂性生物碱和水溶性生物碱两大类。亲脂性生物碱数目较多，绝大多数叔胺碱和仲胺碱都属于这一类，易溶于苯、***、氯仿等极性较低的有机溶剂，在亲水性有机溶剂如丙酮、低碳醇中亦可较好溶解，但在水中溶解度非常小。水溶性生物碱主要指季铵碱，数目较少，易溶于水和酸碱溶液，亦可在醇溶剂等极性大的有机溶剂中溶解，但在低极性有机溶剂中几乎不溶解。大多数生物碱可与酸结合成盐而溶于酸中，加碱至碱性又可以成为游离态，一般来说生物碱的盐易溶于水和低碳醇，难溶于有机溶剂。本文对生物碱制备常用提取与纯化方法，特别是一些新技术的应用进展进行了综述。
1 生物碱提取技术
1.1 生物碱提取的传统方法
选择适宜的提取方法对制备生物碱保持有效成分的活性具有重要意义。目前使用的传统方法按照固液接触状态可分为静态方式（如煎煮、浸渍）和动态方式(如回流、渗漉)。
1.1.1 煎煮
煎煮法（decoction）是中药最早、最常用的制剂方法之一，适用于有效成分能溶于水，且对加热不敏感的药材，能够提取出相对较多的有效成分。
黄际薇等采用酸水煎煮，以苦参碱和氧化苦参碱的提取率为指标，用正交试验法优选了山豆根的提取工艺。M.G. Ortega 等考察了使用煎煮法从石松属药材植物Huperzia Saururus 中提取生物碱，取80g 干燥粉碎后的药材，用600 mL 沸水煎煮2 次，每次时间为1 h，合并提取液后碱化，然后用氯仿萃取，再经有机相蒸发后得到总生物碱0.25 g。
1.1.2 浸渍
浸渍法（maceration）可在常温或加热的条件下浸泡药材获取有效成分，操作简单易行，但所需时间长，溶剂用量大，有效成分浸出率低。常温浸渍是较为常用的生物碱提取方法，如秦学功等考察了苦豆子种子中生物碱的冷浸工艺条件，室温下用稀盐酸提取苦豆籽中的苦参总生物碱，研究不同条件下的总碱浸出率，最高可达3.7％以上。陈月圆等以小檗碱为指标，对黄柏中的总生物碱提取方法进行了优化，分别用水、乙醇和酸作为溶剂，使用乙醇为溶剂的提取率为84.4％，远高于其他两种溶剂。
1.1.3 回流
回流法（circumfluence）是以乙醇等易挥发的有机溶剂为溶媒，对浸出液加热蒸馏，其中挥发性溶剂馏出后再次冷凝，重新回到浸出器中继续参与浸取过程，多采用索氏提取器完成。此法操作简便，提取率较高。龙德清等用酸性醇回流法提取魔芋中总生物碱，得到最佳的工艺条件为在pH 值2～3的酸性醇中回流3 h，总生物碱含量为0.39％。回流法操作时间较长，且整个过程处于加热状态，不适用于热敏性生物碱的提取。
1.1.4 渗漉
渗漉法（percolation）的提取过程类似多次浸取过程，浸出液可以达到较高浓度，浸出效果较好。此法常温操作不需加热，溶剂用量少，过滤要求较低，使分离操作过程简化，尤其适用于热敏性、易挥发且有效成分含量较低或贵重药材提取。采用0.5%的硫酸溶液对中药材黄连用渗漉法提取，收集7 倍量渗漉液即可保证生物碱的提取率，与回流法比较，渗漉法提取物含杂质少、提取率高、使用溶剂量少。渗漉法的操作技术要求较高，否则会影响提取效率，当提取物为黏性、不易流动的成分时，不宜使用该法。
1.2 生物碱提取新技术
随着物理科学的发展，针对传统提取过程中存在的能耗大、有效成分损耗大、杂质较多、效率较低等问题，一些新技术应用于生物碱提取工艺中，在传统方法的基础上利用新技术的强化作用或流体在超临界状态下进行萃取大大提高了提取效率，降低了过程能耗，因其显著优势而成为研究热点。
1.2.1 超声辅助提取
超声辅助提取（ultrasound-assisted extraction，UAE）的3 个理论依据是超声波热学机理、超声波机械机制和空化作用。利用超声技术可以缩短提取时间、提高提取率，并且无需加热，提高了热敏性生物碱的提取率且对其生理活性基本没有影响，溶剂使用量相对较少，可以降低成本。郭孝武对比研究了超声、回流和浸泡3 种方式提取益母草中总生物碱的产率，超声可以使益母草茎组织形态结构发生变化，造成茎内组织细胞损伤，促使益母草总生物碱快速提取，缩短了提取时间。超声提取40 min 比回流提取2 h 产率高42.86％，而所得总生物碱无化学结构改变。国外对于超声提取生物碱也有研究，A. Djilani 等利用超声技术在不同溶剂系统中提取阿托品（atropine），得到最有效的提取溶剂系统为CH3OH/CH3CN(80∶20)，提取率为1.01%。
1.2.2 微波萃取
微波萃取又称微波辅助提取（microwaveCassisted extraction，MAE），利用介电损耗和离子传导的原理，根据不同结构物质吸收微波能力的差异，对某些组分选择性加热，可使被萃取物质从体系中分离进入萃取剂。郭锦棠等对微波与索氏回流方法提取生物碱进行了研究，发现联合微波与索氏提取法对黄连中盐酸小檗碱的提取效果优于单独索氏提取。高姗利用微波萃取，采用正交实验优化了十大功劳叶中小檗碱的提取条件。Fei Zhang 等
对比不同方法提取博落回（Macleaya cordata (Willd)R. Br.）中的血根碱和白屈菜赤碱，如表1 所示，微波萃取比浸渍、超声辅助提取等更为有效。相对于传统方法，微波萃取质量稳定、产量大，选择性高、节省时间且溶剂用量少、能耗较低。但微波萃取受萃取溶剂、萃取时间、萃取温度和压力的影响，选择不同的参数条件，往往得到不同的提取效果。
1.2.3 超临界流体萃取
超临界流体萃取（supercritical fluids extraction，SCFE）是20 世纪90 年代发展起来的一项新型提取技术，利用超临界流体（supercritical fluids，SCF）为萃取剂，从液体或固体中萃取目标组分。SCF 特有的理化性质使其具有比液体溶解能力大、比气体易于扩散和运动且传质速率远高于液相过程的特点，目前普遍采用的SCF 为CO2。超临界流体萃取具有以下优势：(1) 萃取率高；(2) 选择性高，分离彻底；(3) 工艺简单，操作费用低；(4) 操作温度低，适于热敏性物质提取；(5) CO2 无毒、不易燃，安全性高且价格低廉。目前利用超临界流体萃取技术提取天然成分已成为研究热点。张立伟等利用超临界CO2 流体萃取苦参中的总生物碱，提取率为常规方法的2.4 倍，耗时为常规方法的1/3。Liu B等从防己科植物青藤中用超临界CO2 流体提取汉防己碱，在萃取过程中是否加入甲醇改性剂的提取率差别巨大，分别为7.47 mg/g 和0.17 mg/g。

2 生物碱纯化技术
经过溶剂提取后的生物碱溶液除生物碱及盐类之外还存在大量其他脂溶性或水溶性杂质，需要进一步纯化处理，将生物碱成分从中分离出来。通常使用的是有机溶剂萃取、色谱和树脂吸附，随着新技术如分子印迹、膜分离技术的发展和应用，大大简化了过程、提高了纯化效率。
2.1 有机溶剂萃取
有机溶剂萃取（organic solvent extraction）是利用提取物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同达到分离的方法，萃取时组分在两相溶剂中的分配系数越大分离效率越高，分离效果越好。对于亲脂性生物碱，利用非极性和低极性有机溶剂如苯、***、氯仿等与水进行液液萃取；对于水溶性生物碱，利用极性较大的有机溶剂如乙酸乙酯、丁醇等与水溶液萃取。有时可用多种溶剂配置成两相互不相溶的溶剂进行萃取。有机溶剂萃取是生物碱纯化的经典技术，应用广泛，具有操作简单、容易放大的优点，但分离效率和纯度较低，使用大量有机溶剂，操作安全性不佳。
2.2 色谱
色谱法（chromatography）也称层析法，是一种物理分离方法，可以用于分离纯化和鉴定中药有效成分。色谱法包括纸色谱、薄层色谱和柱色谱，其中常用吸附柱色谱纯化生物碱成分，一般使用吸附剂为硅胶和氧化铝。
2.2.1 硅胶柱色谱
利用SiO2・xH2O 作为吸附剂，约90％以上的分离纯化工作均可使用此法。硅胶是中性无色颗粒，性能稳定，分离效率与其粒度、孔径及表面积等因素有关。硅胶柱色谱使用范围广，可作为极性和非极性生物碱的纯化，成本低、操作方便。张兰兰等研究了钩吻总生物碱中钩吻素子的提取与分离，经过溶剂回流提取后，用碱性硅胶柱层析分离钩吻素子取得了很好的效果。
2.2.2 氧化铝柱色谱
以Al2O3 作为吸附剂的层析分离法，根据氧化铝制备和处理方法差异，分为碱性、中性和酸性3种，其中碱性和中性的氧化铝适用于分离酸性较大、活化温度较高的生物碱类成分。有文献报道粉防己生物碱经粗提后用Al2O3 层析方法正向分离非酚性粉防己碱与粉防己诺林碱有较好的效果。需要注意的是Al2O3 的粒度对分离效率有显著影响，一般粒度范围在100～160 目，低于100目则分离效果差，高于160 目则溶液流速太慢。
2.3 树脂吸附
树脂吸附包括离子交换树脂（ionCexchangeresin）和大孔树脂（macroCporous resin）。树脂吸附摆脱了传统纯化法得到的制剂大、黑、粗，使用不方便且溶剂用量大的缺点，因其具有的诸多优势而成为应用日益广泛的纯化技术。
2.3.1 离子交换树脂
离子交换树脂主要通过静电引力和范德华力选择吸附，根据本身特性分为多种类型。针对生物碱的性质选用强酸型阳离子交换树脂，将酸化的生物碱提取液通过树脂，使生物碱盐的阳离子交换到树脂上而与其他成分和杂质分离。经过离子交换后的树脂用氨水碱化得到游离态生物碱，等树脂晾干后根据生物碱的亲脂或亲水性质用相应的溶剂进行提取得到总生物碱。王洪新等分别用动态法和静态法筛选离子交换树脂用于纯化苦豆子中的生物碱，考察了pH 值、助溶剂等因素对纯化效果的影响，对苦参生物碱生产具有指导意义。
2.3.2 大孔树脂
大孔树脂是在离子交换树脂基础上，自20 世纪60 年代初开发出的一类新型高聚物吸附剂，其纯化机理是利用特殊吸附剂――大孔树脂的吸附性和分子筛结合的原理，选择性吸附中药提取液中有效成分，去除杂质。树脂经过洗脱、浸泡、冲洗等过程处理后再生可重复使用。目前多数生物碱成分的纯化都可采用此技术，相对于盐析、沉淀等传统技术，大孔树脂吸附具有以下3 个优点：(1) 溶剂用量少；(2) 产品质量高，稳定性好；(3) 生产周期短、设备简单。这些优良的性能使大孔树脂吸附在近年来受到越来越多的关注。聂其霞等比较了醇沉、大孔树脂吸附和吸附澄清3 种方法对黄连解毒汤中小檗碱含量的影响，如表2 所示，大孔树脂法为最佳的纯化方法。
2.4 分子印迹
分子印迹技术（molecular imprinting technology，MIT）是20 世纪末出现的一种高选择性分离技术，通过印迹、聚合、去除印迹分子3 步制备分子印迹聚合物（MIPs），以其特定的分离机理而具有极高的选择性，可以作为高度专一的固相萃取材料。黄晓冬等制备了辛可宁（cinchonine)分子印迹聚合物手性整体柱，可在2 min 内实现非对映异构体辛可宁和辛可尼丁（cinchonidine)分离。目前MIT 分离生物碱的技术尚属研究阶段，需要在热力学及动力学性质、MIPs 制备、降低成本等方面作进一步探索。
2.5 膜分离
膜分离技术（membrane separation technology，MST）是一项新兴的高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力（如压力差、化学位差、电位差等），使原料液中组分选择性通过膜。以压力差为推动力的膜分离过程包括微滤、超滤、纳滤、反渗透，根据筛分原理使某些组分选择性透过，实现提纯和浓缩。以电位差为推动力的膜分离过程主要是电渗析，利用带电离子在电场下的移动和离子交换膜的选择透过性实现分离、提纯，所用离子交换膜的分离原理与离子交换树脂相同。
与常规的离心、沉降、过滤、萃取等传统技术相比，膜分离技术的优势表现为：(1) 分离过程无相变，高效节能环保；(2) 分离设备简便易操作；(3)周期短、安全性高。膜分离技术作为一项新型分离、提纯手段，对于我国中药产业的技术改造和现代化发展具有重大意义。
2.5.1 超滤
超滤(ultra filtration，UF)的孔径范围为1～100nm，截留相对分子质量为103～106。一般来说生物碱的相对分子质量多在1 000 以下，而提取液中的一些蛋白质、多肽、多糖等无效成分相对分子质量大于104，因此超滤技术可以作为纯化生物碱的有效手段。
马朝阳等用中空纤维膜对苦豆子盐酸提取物中的生物碱进行了超滤纯化的研究，结果表明超滤可以有效去除苦豆子盐酸提取物中的蛋白质和其他杂质，透过液中总生物碱回收率达93.5％。李淑丽等比较了超滤与醇沉法对黄连解毒汤中有效成分小檗碱的纯化效果，实验结果表明超滤能够更多去除料液中的杂质，生物碱有效回收率为95％，明显高于醇沉法73％的有效回收率。不同的膜会对生物碱提取产生影响，黄罗生等探讨了不同截留相对分子质量的超滤膜对四逆汤中乌头总碱的影响，结果表明乌头总碱的损失与超滤膜截留相对分子质量成反比。
2.5.2 微滤
微滤(micro filtration，MF)的孔径在102～104nm，一般作为纯化的前处理过程，可以起到很好的过滤杂质的效果，高红宁等利用无机陶瓷微滤膜对苦参水提取液进行处理，微滤后可以得到澄清透明液体，固形物去除率为39.5％，与醇沉法相当，生物碱保留率在79.72%，结合大孔树脂法精制苦参中氧化苦参碱，保留率为78.88％，高于醇沉法，保留更多有效成分和更彻底去除杂质。膜分离技术相对其他分离技术具有显著的优势，但也存在一些亟待解决的问题，如膜在使用过程中的抗污染能力不强，通量衰减造成性能下降，使用寿命短等，尚需在膜材料的选择、优化预处理和清洗方法上作进一步的研究。
3 结 语
生物碱是中药中具有生理活性的重要组分，快速高效、节省能源、简便易行的提取与纯化工艺对中药工业现代化具有重要意义。目前较为常用的提取与纯化技术比较成熟，但存在溶剂、能源消耗大且效率不高的问题，合理使用一些新技术可以有效改善提取与纯化效果，使生物碱制备向高效节能的方向发展。实际生产时应根据生物碱特有的理化性质，选择合适的提取与纯化技术，为了能够扬长避短，还可以多种技术联合使用，探寻最佳的工艺条件与作用机理。采用与离子交换树脂分离原理相同的离子交换膜为分离介质、以电位差为推动力的电渗析技术尚未应用于生物碱纯化，在此方向的研究具有潜在的应用价值，随着人们对膜分离过程理解逐渐深入、高性能膜与膜分离装置不断出现，膜分离技术在生物碱制备中的应用前景会越来越广阔。总之，不断探索和完善的提取与纯化技术，将会使生物碱制备向具有绿色、现代化的方向发展。