钩藤为常用中药, 其主要活性成分为钩藤生物碱 , 其中, 钩藤碱( Rhynchophyline) 、异钩藤碱( Isorhynchophyline) 含量较高 。由于钩藤在治疗高血压、改善血液循环及脑功能方面呈现良好效果, 因此受到国内外医药工作者的重视, 已对其资源、提取工艺、含量等进行了研究 , 但对其体内药物研究尚鲜有报道。本作者在钩藤生物碱分离提取及其制剂研制工作基础上, 用HPLC 方法对钩藤生物碱在大、小鼠体内的代谢情况进行了初步考察, 建立了钩藤生物碱生物体内样品分析方法, 以期为钩藤生物碱的药物动力学及其药物配伍的机理研究建立方法基础。
1 仪器与材料
仪器: 岛津LC -7A 高效液相色谱仪, 色谱柱:Phenomenex C18 5μm (4.0 mm ×250 mm) 。
对照品: 钩藤碱、异钩藤碱, 自制, 纯度为99.7 % (中国科学院生态环境中心测定) 。
内标物: 卡马西平购自中国药品生物制品检定所。
试剂: 甲醇、***、三乙胺均为国产分析纯。
动物: 昆明小鼠30 只, Wistar 大鼠10 只。
抗凝剂: 肝素, 麻醉剂: 水合氯醛, 北京中医药大学药理室提供。
钩藤总碱: 自制。
2 色谱条件
流动相: 甲醇-水(55∶45) , 含0.01 mol/L三乙胺, 冰醋酸调pH 7.5 。流速: 1.0 mL/min, 检测波长: λ= 254nm。进样量: 20μL 。
3 标准曲线制作
3.1 钩藤碱、异钩藤碱对照品储备溶液的配制
精密称取钩藤碱1.10 mg、异钩藤碱1.05 mg , 用1 %盐酸定容于10 mL 容量瓶中, 得对照品储备液, 浓度分别为: 钩藤碱0.110 mg /mL 、异钩藤碱0.105 mgmL 。
3.2 内标储备溶液的配制
精密称取卡马西平5.50mg , 甲醇定容于5 mL 容量瓶中, 得内标储备液。
3.3 标准曲线的制作
精密吸取钩藤碱、异钩藤碱对照品储备液1 、2 、4 、8 、16μL , 分别加入大鼠空白血浆0.50 mL , 再各准确加入内标储备液10μL , 混匀, 氨水调pH 11 , 加入***2.0 mL 萃取,***萃取液挥干, 加入甲醇0.20 mL , 得1～5 号对照品溶液。进样20μL 进行液相色谱分析, 以组分与内标的信号比对组分浓度做标准曲线, 求得回归方程为:
Y钩藤碱= 0.087 X C 0.020 r = 0.9991
Y异钩藤碱= 0.092 X C 0.005 r = 0.9994。
钩藤碱、异钩藤碱分别在0.550～8.80μg/mL及0.525～8.40μg/mL范围内线性良好。
4 生物样品测定
4.1 钩藤总碱灌胃液配制
称取钩藤总碱100 mg ,溶于1 %的盐酸溶液20 mL 中, 经HPLC 测定, 其中钩藤碱、异钩藤碱含量分别为0.77 、1.04 mg/mL。
4.2 大鼠体内钩藤生物碱血药浓度一时间关系初探
大鼠(每只约400 g) 3 只, 灌服钩藤总碱盐酸盐溶液, 剂量为100 mg/kg, 然后用10 %水合氯醛生理盐水麻醉, 分别于灌胃后40 、60 、80 、110 、130 min 下腔静脉取血, 每次1.0 mL , 血液加0.5%肝素0.1 mL 抗凝, 离心取血浆。血浆0.5 mL ,加氨水调pH 11 , 加内标储备液10μL , 混匀, 加入***2.0 mL 萃取, 萃取液挥干, 准确加入甲醇0.20 mL , 溶解, HPLC 测定。结果见图1。
由上述测定结果可以看出, 大鼠口服钩藤生物碱后约2 h , 体内血药浓度开始下降。
4.3 钩藤生物碱在大鼠体内的分布
雄性大鼠3只(每只约300 g) , 灌服钩藤总碱盐酸盐溶液, 每天2 次,剂量为100mg/kg, 3 d 后处死, 取大鼠肝、小肠、肾、大脑, 生理盐水洗净, 滤纸吸干, 称取各脏器0.5g ,加1 %盐酸2.0mL, 匀浆, 离心, 取上清液1mL , 氨水调pH11 , 加入内标储备液10 μL , 混匀, ***萃取, 萃取液挥干, 加入甲醇0.20 mL 溶解, HPLC 测定,
4.4 小鼠体内钩藤生物碱血药浓度―时间关系初探
配制浓度为50mg/mL的钩藤总碱药液, 按剂量400mg/kg给雄性小鼠灌胃, 分别在灌胃后20 、40 、60 、90 、120 、150 、180 、210 min 由小鼠眼球取血, 每个时间点用3 只小鼠, 鼠血加0.5 %肝素抗凝, 离心, 取血浆0.5 mL , 加入内标储备液10μL , 氨水调pH 11 , 混匀, 加入***2 mL 萃取, ***液挥干, 准确加入甲醇0.20 mL 溶解, HPLC 测定。
5 结果
5.1 精密度测定：取2 、4 号钩藤碱、异钩藤碱对照品溶液, 按标准曲线制作时操作步骤测试, 每个浓度平行做5 份, 测得精密度, RSD 钩藤碱为2.1 %～6.6 %; 异钩藤碱为4.0 %～4.9 %。
5.2 加标回收率实验：取4份已测钩藤碱、异钩藤碱含量的血浆样品各0.5 mL , 分别加入钩藤碱、异钩藤碱盐酸盐对照品储备液0 、4 、8 、16μL , 加入10μl 内标液(1.10mg/mL ) , 经碱化, ***萃取,萃取液挥干, 加入甲醇0.20 mL , 分别得到低、中、高浓度加标液, HPLC 测定, 求加标回收率, 结果钩藤碱: 95.5 %～ 109.5 %; 异钩藤碱: 106 %～108 %。RSD < 5 % ( n = 3) 。
5.3 方法最低检出限：本实验条件下, 测得最大噪音为472 , 按噪声二倍原则求得最低检出限为: 钩藤碱0.33μg/mL , 异钩藤碱0.14μg/mL。
5.4 其他方法探索：为了能寻找一个更简便的方法, 又初步实验了甲醇沉淀法, 方法如下: 取空白血浆0.5 mL , 分别加入不同浓度的钩藤碱、异钩藤碱甲醇溶液(含11.0μg/mL内标液) 0.2 mL , 沉淀, 离心, 取上清液过微孔滤膜, 滤液进样分析,以所测组分与内标的信号比对浓度做标准曲线, 求得回归方程:
Y异钩藤碱= 0.097 X - 01025 r = 0.9997
Y钩藤碱= 0.095 X + 0.018 r = 0.9999
钩藤碱、异钩藤碱分别在1.05～8.60 μg/mL及1.10～17.60μg/mL范围内呈线性, 方程中的变量X为未加入血浆前钩藤碱、异钩藤碱甲醇对照品溶液浓度。该方法简便, 但由于沉淀后的上清液体积不易准确测量, 所以本方法适于样品相对含量的比较。如果样品中生物碱含量太低, 由于浓缩较困难,也不适宜本方法。
5.5 实验动物体内样品鉴定
取灌药后的实验动物体内样品(血浆、脑、肝、小肠) , 经甲醇沉淀处理后, 取上清液, 进行HPLC ―MS 分析(由中国科学院生态环境研究所测定) , 并与钩藤碱、异钩藤碱对照品的保留时间及质谱图比较, 发现所对应的信号完全一致, 表明实验动物体内样品有钩藤碱、异钩藤碱原型药。
6 小结
由以上实验可见, 钩藤生物碱在体内有游离的原型药存在, 且已经过了HPLC ―MS 图谱鉴定。
初步的大、小鼠体内药时曲线实验表明, 钩藤生物碱在体内代谢较慢, 约在灌胃后2 h 达到高峰,然后迅速代谢。
钩藤生物碱在体内分布较广, 测得脑、肝中含量较高, 表明该类生物碱易通过血脑屏障, 适于脑部的病理改善, 也进一步证明了钩藤平肝熄风之功能。
本方法灵敏度高、准确度好、条件易控制, 为钩藤生物碱的药物动力学研究建立了一个稳定可靠的方法。
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