反相高效液相色谱法测定复方头孢氨苄胶囊中头孢氨苄和甲氧苄啶的含量

摘　要：建立一种用反相高效液相色谱法检测复方制剂中头孢氨苄和甲氧苄啶含量的方法.头孢氨苄浓度为0.05～2.00 mg/mL、甲氧苄啶浓度为0.01～0.40 mg/mL时存在良好的线性关系.头孢氨苄回收率为100.4%，RSD=0.58%(n=7);甲氧苄啶回收率为100.2%，RSD=0.62%(n=7).
复方头孢氨苄胶囊为一种常用的β-内酰胺类抗生素，广泛得到应用.广东省药品标准〔1〕分别采用了碘量法和抽提后比色法测定其中的头孢氨苄和甲氧苄啶含量.这两种方法操作复杂，费时费力.作者建立反相高效液相色谱外标法同时测定复方头孢氨苄胶囊中的头孢氨苄和甲氧苄啶含量.

1　仪器、药品与试剂

SP液相色谱仪: SP8810单元泵、SP8450紫外可见光检测器、SP4290积分仪,MILLI-Qlabo超纯水器.头孢氨苄、甲氧苄啶对照品由中国药品生物制品检定所提供.乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯.

2　色谱条件

色谱柱：Hypersil BDS C8(5 μm,4.6 mm×250 mm) 流动相：乙腈-0.01 mol/L氯化铵-0.01 mol/L庚烷磺酸钠-冰醋酸（体积比为25∶70∶5∶0.2）;流速1.0 mL / min;检测波长296 nm;AUFS:0.01;室温；进样10 μL.

3.1　线性试验

精密称取头孢氨苄500 mg置于100 mL容量瓶中,加入流动相适量，振摇溶解，加流动相稀释至刻度,作为备用液A；另精密称取甲氧苄啶对照品100 mg,置于100 mL容量瓶中，加入适量流动相，振摇使溶解，加流动相稀释至刻度,作为备用液B.同时取备用液A、B各20、10、5、2.5、2、1、0.5 mL ,分别置于50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，测定.得到的浓度C(μg/mL )与峰面积A的线性方程分别为：
头孢氨苄：A=57 211+143 320 C，r=0.999 6(n=7)；
甲氧苄啶：A=22 132+61 362 C，r=0.999 8(n=7).
结果表明在50～2 000 μg/mL、10～400 μg/mL范围内头孢氨苄和甲氧苄啶的线性关系良好.

3 .2　稳定性实验

在本实验条件下，样品溶液室温放置1、2、4、8、16、24 h，测得头孢氨苄和甲氧苄啶的含量无明显变化.

3. 3　回收率实验

精密称取625 mg头孢氨苄对照品和125 mg甲氧苄啶标准品于100 mL容量瓶中，加入适量的流动相，超声15 min溶解，加流动相至刻度，制成备用液C.
按处方量称取适量的空白颗粒于50 mL容量瓶中，向其中加入5 mL备用液C，加入流动相，超声5 min溶解，用流动相定容,摇匀，用滤纸过滤，取续滤液进样.根据混合对照品中头孢氨苄和甲氧苄啶的峰面积计算回收率，头孢氨苄为100.4%,RSD=0.58% (n=7) 甲氧苄啶为100.2%,RSD=0.62% (n=7).

3.4　空白干扰实验

按处方量称取适量的空白颗粒于100 mL容量瓶中，用流动相溶解，定容，滤纸过滤，取续滤液进样，在检测过程中无干扰出现，可排除辅料干扰.

3. 5　样品测定

精密吸取备用液C 10 mL于100 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液.取复方头孢氨苄胶囊 20粒,计算平均囊重，精密称取0.5粒,置于100 mL容量瓶中，加入流动相适量，超声10 min溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀.用滤纸过滤，取续滤液为样品溶液.分别取样品溶液和对照品溶液10 μL进样，外标法计算头孢氨苄和甲氧苄啶的含量.结果见表1.

Tab.1　Analytical result and comparison between cefalexin and trimethoprim in the sample

Batch No Cefalexin Trimethoprim
HPLC method
Medicine standard
method of province HPLC method
Medicine standard
method of province
981010
99.29
100.43
102.57
101.06

981012 97.26 95.03 106.72 106.74
981013 100.49 98.74 104.29 104.72
981014 95.11 95.45 104.67 105.14
981082 94.75 94.37 99.91 99.66
981084 93.76 94.92 96.38 98.24
981087 92.02 92.21 93.01 93.09

经配对t检验，头孢氨苄t=0.131 2，t＜t0.025，12；甲氧苄啶t=0.146 1，t＜t0.025，12,显示无显著性差异
4　讨论

a.广东省药品标准〔1〕头孢氨苄是采用碘量法〔2〕,甲氧苄啶是采用氯仿反复提取，再比色.这两种方法要经过复杂的操作，繁琐的提取分离处理，干扰严重，而且实验人为带入的误差很大.作者建立高效液相色谱法测定复方头孢氨苄胶囊中的头孢氨苄和甲氧苄啶含量,省去复杂的前处理，缩短分析时间，具有简便、快速、结果准确可靠的特点.
b.参阅5年内已发表的文献，经统计，高效液相色谱法用于测头孢氨苄的有2种内标法〔3，4〕，且分析时间长，而本方法分析时间短，只需7 min可以完成两种成分的检测。有文献〔5〕用外标法测定甲氧苄啶和头孢氨苄的含量，按其方法作者没有得到满意的基线分离，且该文献也报道其稳定性不好.本法则更稳定，对照品常温放两周，无明显变化.
c.在流动相的选择中，开始采用甲醇-氯化铵溶液体系为流动相〔6〕，发现有许多为未知杂质，且基线不够平直.改为乙腈-氯化铵溶液系统，未知杂质多的现象消失，且基线更稳、更平直.改变流动相pH值，可使头孢氨苄和甲氧苄啶的分离效果改善.通过调试不同比例、不同酸度的流动相，最后选择了乙腈-氯化铵溶液系统作流动相，使得甲氧苄啶和头孢氨苄得到很好的分离.