克拉霉素含量测定方法

　　克拉霉素为6-O-甲基红霉素。2005版《中国药典》对克拉霉素、克拉霉素片、克拉霉素胶囊的含量测定方法进行了修订，增加高效液相色谱法；新增克拉霉素颗粒的HPLC含量测定方法。文献报道的克拉霉素及其制剂的含量测定方法主要有高效液相色谱法和分光光度法等。现将克拉霉素、克拉霉素片、克拉霉素胶囊及克拉霉素颗粒的含量测定方法作一总结。
一、高效液相色谱法
2005版《中国药典》克拉霉素含量测定项下：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾9.11g，加水溶解并稀释至1000ml，加三乙胺2ml，用磷酸调节pH值至5.5）-乙腈（600：400）为流动相；检测波长为210nm；流速为每分钟1.0ml；柱温45℃。理论板数按克拉霉素峰计算不低于3000；拖尾因子不得过2.0；克拉霉素峰与相邻各杂质峰的分离度应符合要求。克拉霉素用流动相溶液溶解。
克拉霉素片、克拉霉素胶囊及克拉霉素颗粒的含量测定按克拉霉素含量测定项下的方法测定。
文献报道的HPLC法，采用的流动相系统多为磷酸盐缓冲液-乙腈（甲醇），另外杨雁莉等采用三种方法测定克拉霉素及其制剂的含量。Waters Breeze HPLC系统(717自动进样器、2487双通道紫外检测器、1525高压二元泵)；SP8800HPLC仪(SP8800HPLC泵、SP200紫外检测器、4400积分仪)。C18柱(200mm×4.6mm，5μm)，大连依利特分析仪器有限公司)，C8、Cl8柱(150mm×4.6mm，5μm，美国Agilent公司)。色谱条件：方法(A)：ODS色谱柱，流动相为磷酸二氢钾溶液(0.067mol/L)-甲醇(400：600)(pH4.0)，检测波长210nm，流速1.0 ml/min，柱温35℃，进样量50μL。方法(B)：ODS色谱柱，流动相为磷酸二氢钾溶液(0.067 mol/L)-乙腈(55：45)，检测波长210nm，流速0.8ml/min，室温测定，进样20μL。方法(C)：C8色谱柱，流动相为磷酸盐缓冲液(0.O67mol/L，pH4.0)-乙腈(55：45)，检测波长210nm，流速1.0ml/min，柱温50℃，进样量20μL。三种方法线性范围均为0.025～2.0mg/ml（r=0.9999），最低检出浓度为0.01 mg/ml。
俞承进采用HPLC内标法测定克拉霉素的含量。岛津高效液相色谱仪，CLC-63-泵，SPD-6AV检测器，C-R6A数据处理仪。色谱柱：Turner C18柱（5μm，15cm×4.6mm）； 流动相：0.025mol／L磷酸氢二铵溶液(pH6.3)-乙晴(3：2)；内标液：对羟基苯甲酸丁酯；流速为1.0ml／min；检测波长：210nm；进样量2μL；纸速：lcm/min；0.32aufs。线性范围为100～1O00μg／ml，最低检测浓度为10μg／ml，信噪比为3。
郭琴等采用HPLC法测定克拉霉素片的含量。岛津LC-9A 泵，SPD-6A检测器，( R-6A积分仪。岛津LC-10A泵，SPD-10AD)检测器，CLASS-10色谱工作站 Waters 510泵，486检测器，717自动进样器，CR-7A 积分仪。岛津shim CLC-ODS，5μm，(i.d 6mm×150mm)色谱柱；室温；流动相：乙腈-0.05mol／L磷酸氢二铵溶液(2：3)，pH=6.9；检测波长210nm；流速：1.0ml／min；进样量：20μL。用外标法定量，线性范围：0.6～1.8mg／Ml。
李平等法测定克拉霉素胶囊的含量。仪器：岛津高效液相色谱仪LC-10A；检测器：SPD-10；数据处理机C-R6A；恒温箱(Waters)。色谱柱：μ-Bandapak C18(10μm，4.6mm×300mm)；流动相：0.067mol／L磷酸二氢钾-乙腈(60：40，V／V)；流速：1ml／min；检测波长：210nm； 柱温：45℃。浓度在200～1000μg／ml范围间线性良好(r=O.9999)。
王庆全等采用HPLC法测定克拉霉素颗粒剂中克拉霉素的含量。日本岛津LC-10AD HPLC仪，SPD-PA可调波长紫外见可见光检测器，C-R6A数据处理机。色谱柱：Kromasil C18(5μm，200mm×4.6mm)；流动相：0.067mol／L磷酸二氢钾-乙腈(60：40，v／v)；流速：0.7ml／min；检测波长：210mm；进样量：20μL。在80～800μg／ml范围中，线性关系良好(r=0.9997)。

二、分光光度法
此法应用比较普遍，有荷移分光光度法和间接分光光度法等。如：李华侃等利用克拉霉素与茜素在水一醇介质中发生电荷转移反应，形成电荷转移络合物，采用可见分光光度法测定克拉霉素片和胶囊的含量。7590型UV-VIS单光束自动扫描分光光度计(山东高密分析仪器厂)；721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)。荷移反应生成的荷移络合物在546.lm处有最大吸收，络合物的组成比是l：l，稳定常数是3.4×l04，表观摩尔吸光系数7.31×l03L(mol/cm)，药物浓度在l～100mg／L范围内服从比耳定律，方法平均回收率在98.O％以上，克拉霉素浓度为50mg／L时，相对标准偏差(RSD)为1.30％(n=6)。
陆本乐等采用间接分光光度法测定克拉霉素胶囊的含量。TU-1901型分光光度计(北京普析通有仪器有限公司)，751 GW(上海分析仪器厂)。采用少量甲醇将克拉霉素溶解后，再用0.1 mol/L 醋酸盐缓冲溶液稀释至适宜浓度，加入硫酸显色后在482nm波长处直接测定。线性范围10～30mg/L，r=0.9994，平均回收率100.5％，RSD=0.30％。

三、比色法
该法虽然较少应用，但操作简单。如：冯玉欢等采用比色法测定克拉霉素片半成品含量。岛津UV-160A紫外分光光计。检测波长482 nm，在 12～36μg／mL范围内具有良好的线性关系。用比色法完全可以取代微生物检定法测定克拉霉素混粉的含量，并且此法简便，可快速准确地控制半成品质量。本法也可用于快速测定克拉霉素片成品的含量。

四、极谱法
电化学方法测定克拉霉素的含量报道很少，如：孙家娟等考察了克拉霉素的示波极谱测定及其电化学行为。在O.05mol／LNa0H(pH 12.7)介质中，克拉霉素在滴汞电极上产生一灵敏的还原峰，峰电位Ep=-1.35V(vs．SCE)。其一阶导数峰电流ip’与克拉霉素浓度在8.0×10-6～4.8×10-5mol／L范围内有良好的线性关系(r=0.9991)，检出限为4.0×10-6mol／L。此法已用于片剂的测定。用线性扫描和循环伏安法研究了体系性质，结果表明，克拉霉素的电极过程为具有吸附的不可逆过程。