微柱高效液相色谱法测定金银花中的多酚类物质

摘要：研究了用微柱高效液相色谱法测定金银花中的几种多酚类物质(氯原酸、木犀草黄素、木犀草黄素-7-葡萄糖甙、木犀草黄素．7-半乳糖甙、槲皮素及槲皮素-3-葡萄糖甙)的方法。金银花样品中的多酚类物质用甲醇加热回流提取，然后以Waters Xterra RP18(1.0mm×50mm，2.5mm)微柱为固定相，1％的醋酸和甲醇梯度洗脱为流动相分离，在该色谱条件下，金银花中6种多酚类成分在4min内可达到基线分离；用紫外二极管矩阵检测器检测。方法标准回收率为97％～104％；相对标准偏差为1.6％～2.3％。测定了几种金银花样品中的多酚类物质，结果满意。
关键词：高效液相色谱，固相萃取，金银花，多酚，微柱
1 引 言
金银花(1onicera japonica)为忍冬科植物的干燥花蕾，它是一种“药食同源”的绿色天然产物，在我国分布广泛，产量较大，是一种重要的可再生资源。多酚类物质(主要是黄酮类和氯原酸)是金银花的主要有效成分。目前对金银花中多酚类物质的测定，主要有紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等，其中，高效液相色谱法是最常用的方法 。由于微柱高效液相色谱具有流动相消耗少，分析时间短，可不分流直接和质谱联用等特点，近几年来得到了迅速发展。实验研究了用微柱高效液相色谱分析金银花中多酚类物质的方法，金银花中6种多酚在4min内可达到基线分离。方法用于几种金银花样品分析，结果满意。
2 实验部分
2．1 仪器与试剂
Allaince高效液相色谱-质谱联用仪(美国Waters公司)，包括2690分离系统(四元泵、柱温箱及自动进样器)；996紫外二极管矩阵检测器；TMD热束质谱检测器；Millennium色谱管理软件。
甲醇：高效液相色谱专用(Fisher公司)；水为石英亚沸蒸馏水并用Milli-Q50(美国Millipore公司)超纯水仪处理，电阻率大于18MΩ・cm；氯原酸，木犀草黄素，木犀草黄素-7-葡萄糖甙，木犀草黄素-7-半乳糖甙，槲皮素，槲皮素-3-葡萄糖甙标样(分别购于Fluka公司、Sigma公司和美国Chromadex公司，含量>95％)。
2．2 色谱条件
色谱柱：Waters Xterra RP18(1.0 mm×50 mm，2.5μm)，Waters Sep-Pak-C18固相萃取小柱(1mL，30 mg，30μm)；流动相为：A．甲醇；B．1％ 醋酸溶液，按0 min(A 20％ +80％B)，1.5min(A 4O％ +B 60％)，3.0 min(A 8O％+ B20％)的线性梯度条件，流速为0.2 mL／min；进样体积2.0μL；检测波长为345nm。在上述色谱条件下，样品和标样的色谱图。
2．3 样品处理
样品粉碎后过0.45mm粒径筛，准确称取样品约0.4g，加入45mL 80％甲醇水溶液加热回流45min，冷却，过滤并定容到50mL，取5mL滤液，以10mL／min流速通过预活化好的Waters Sep-Pak-C18固相萃取小柱，弃去最初的3 mL，收集后面的2mL，用0.45μm针头过滤器过滤，进样2.0μL进行分析。
3 结果与讨论
3．1 分离条件的选择
用甲醇-水作流动相时有的色谱峰稍拖尾。这可能是因为酚羟基易产生电离，在固定相表面有双重的保留机制。改用甲醇一l％醋酸溶液作流动相可使酚的电离被抑制，成为中性分子在反相条件下的疏水缔合物，使分离效果和峰型得到较大改善。实验表明，按0 min(A 20％ +80％B)，1.5 min(A 40％ +B 60％)，3.0 min(A 80％ +B 20％)的线性梯度条件可使样品中的待测组分达到基线分离，且分离时间短，因此实验选用该流动相。
3．2 检测波长的选择
由紫外二极管矩阵检测器200～400nm波长扫描可得各色谱峰的光谱图。样品中各多酚均由其保留时间及紫外光谱图与标样对照确定，并作了峰纯度分辨，确认各测定组分均达到完全分离；由于各多酚类物质在345nm左右均有较大吸收，因此实验选择检测波长为345nm。
3．3 样品前处理
多酚类物质在极性有机溶剂中具有较大的溶解度，在热甲醇液中溶解性较好，故实验选用80％甲醇为提取剂。对于0.4g左右的样品，用40mL浓度在70％以上的甲醇溶液加热回流提取0.5h以上可提取完全，实验选用80％甲醇45mL加热回流提取45min。
金银花中除含有多酚类物质外，还含有油脂类物、蜡质、色素等 。弱极性物质。该类物质会影响多酚类物质的检测，并且在本实验的流动相条件下不能完全洗脱下，在C18柱上残留积累，使色谱系统的反压增大，并降低柱效，故样品分析前需作脱脂处理。常规样品处理采用正己烷、石油醚等非极性有机溶剂进行脱脂，但是用有机溶剂脱脂时间长，操作麻烦，还会在一定程度上造成多酚类物质损失，影响分析结果。因此实验先用80％甲醇回流提取样品中的多酚类物质，提取液用C18固相萃取小柱脱脂的方法。用Waters SPE真空提取装置，每次可同时处理20个样，小柱活化和样品预分离的流速均为10 mL／min，小柱用3 mL甲醇活化，然后用10 mL水洗净小柱上的甲醇，取80％ 甲醇的样品提取液通过小柱。这样，弱极性物质脂类、蜡质、色素等保留在小柱上，而多酚类物质在小柱上不保留，可简便快速的达到样品纯化的目的，用固相萃取脱过脂的样品可直接进样进行色谱分析。
3．4 回归方程、相关系数及检出限
分别配制浓度为100、20、4.0和0.8 g／L的标准溶液，进样后根据不同浓度的峰面积计算出回归方程。根据信燥比S／N=3，测得各组分最低检测浓度。
3．5 回收率实验及精密度
准确称取相同样品两份，其中一份加入已知量多酚标样，另一份不加，每份样品平行测定5次，通过加入标准的测出量除以标准加入量计算回收率，并计算相对标准偏差。
3．6 样品分析结果
金银花样品采集后按1．3样品前处理的方法处理进样分析。
本方法采用甲醇回流提取金银花中的多酚类物质，用固相萃取预分离，微柱高效液相色谱法测定金银花中的6种多酚类物质，在4min内可达到基线分离。分析时间比常规色谱柱明显缩短，而且流动相流速只需0.2 mL／min，比常规色谱柱(流动相流速0.5～2.0mL／min)流动相消耗减少。用固相萃取预分离脱脂克服了用有机溶剂脱脂时间长、操作麻烦，会造成多酚类物质损失的缺点，而且固相萃取易实现操作自动化，使样品前处理更为简便快速，结果可靠，在一定程度上为金银花中的多酚类物质研究提供了方法。