高效液相色谱法测定5种不同产地丹参中丹参素和原儿茶醛含量

摘要：目的：测定5种产地丹参中丹参素、原儿茶醛的含量。方法：采用高效液相色谱法，Kromasil分析柱(250 mmx46mm，5μm；流动相：甲醇-1Og／L冰醋酸20：80；紫外检测波长：280nm；流速：1.0ml／min。结果：丹参素在4.2―33.6μg／ml，原儿茶醛在O.36―1.80μg/ml范围内线性关系良好，丹参素和原儿茶醛最低检测限分别为1O.5 ng和0.6 ng，回收率分别为99.36％(RSD为1.26％)和97.54％(RSD为O.81％)。结论：该方法简便、灵敏、准确，样品处理简便易行，在考察评价丹参药材质量上有实用价值。不同产地的丹参，其丹参素和原儿茶醛含量有一定差异。
关键词：丹参；丹参素；原儿茶醛；高效液相色谱法
丹参为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。现代中药药理学研究表明，丹参能够增加冠状动脉血流量、降血脂、抑制血栓形成或抗血栓、改善微循环作用。其主要有效成分为水溶性酚性酸(丹参素和原儿茶醛)及脂溶性二萜醌类(丹参酮Ⅱ A)。传统和现代医学使用丹参，主要是以其水溶性成分为主的各种制剂。因此，为了临床和科研的需要，笔者用高效液相色谱法对丹参中水溶性成分丹参素和原儿茶醛进行测定，比较5种产地丹参中丹参素和原儿茶醛的含量。
1 材料
1．1 仪器美国Waters公司产高效液相色谱系统(7725手动进样器，6O0泵，996二级管阵列检测器，M豫数据处理系统)，Digital 586计算机，TGL・16G台式高速离心机，Sz-93自动双重纯水蒸馏器，TN-100 B型托盘扭力天平，GB-204 型电子天平。
1．2 药材陕南丹参，购自陕西省药材公司；洛阳丹参，购自河南省洛阳药材站；蒲城丹参，购自陕西省蒲城药材公司；卢氏家种丹参、卢氏野生丹参，均购自河南省三门峡药材采购供应站中成药经营部。以上5种产地丹参均经中国人民解放军第四军医大学药物研究所孙玲变副主任药师鉴定为唇形科植物丹参(Salvia mihiorrhiza Bge)的干燥根茎。
1．3 试剂甲醇，购自天津化学试剂有限公司，分析醇；冰醋酸，购自陕西省西安化学试剂厂，分析醇；丹参素钠标准品：购自中国药品生物制品检定所，编号855-200102；原儿茶醛标准品：购自中国药品生物制品检定所，编号0810-9803；水为自制双蒸水o
2 方法与结果
2．1 色谱条件色谱柱：中国科学院大连物理化学研究所KF系列HPLC柱。Kromasil Cl8：250 mm x4.6 mm，5μm，NO：Cl8B 021110；流动相：甲醇一1Og／L冰醋酸(20：80)；流速：1.0 ml／min；检测波长：280nm；检测灵敏度：0.001AUFS；柱温：18℃；分离度：1O.34；理论塔板数(以丹参素计算)为6390。
2．2 线性范围精密称取丹参素和原儿茶醛对照品适量，分别用lOg／L冰醋酸配制成浓度为0.21mg／ml和0.12 mg／ml的对照品母液。用微量加样器分别吸取丹参素对照品母液200，400，800，1000，1200，1600 μl；原儿茶醛对照品母液3O，6O，90，105，120，150μl，以对应顺序加入lOml棕色容量瓶中，加lO g／L冰醋酸至刻度线，配制成6种不同浓度的混合对照品溶液。用微量进样器吸取5μl进样，以峰面积为纵坐标，对照品进样量(ng)为横坐标，进行线性回归(n=6)。得丹参素和原儿茶醛的回归方程为：y=-86.75+158.54x，r=0.9997；Y=16.45+1751.28x，r=0.9990。结果表明，丹参素在4.2～33.6μg/ml、原儿茶醛在0.36―1.80μg/ml范围内呈现良好的线性关系。
2．3 精密度试验 精密吸取丹参素浓度为21.00μg/ml，原儿茶醛浓度为1.26μg／ml的混合对照品
溶液重复进样5次，丹参素和原儿茶醛峰面积积分值RSD分别为0.37％和0.28％(n=5)。
2．4 重复性试验取同一产地药材样品(卢氏野生丹参)煎液，按样品溶液预处理方法制备5份，分别进样5μl，结果丹参素和原儿茶醛峰面积积分值RSD分别为0.38％和0.33％。
2．5 稳定性试验 取同一产地供试品溶液(卢氏家种丹参)在0，2，4，6，8h分别测定，记录丹参素和原儿茶醛峰面积，结果峰面积RSD分别为1.17％和0.49％。表明供试品溶液稳定。
2．6 最低检测限测定取混合对照品溶液，用l0g／L冰醋酸依次稀释制成一系列由高到低的梯度浓度溶液，在上述色谱条件下分别进样，取峰高为噪声3倍时的进样量为最低检测浓度，由进样量20μl得出最低检测限。结果丹参素和原儿茶醛的最低检测限分别为lO.5 ng和0.6 ng。
2．7 回收率测定取卢氏家种丹参煎剂200μl，加入5ml塑料高速离心管中，同时精密用微量加样器精密量取丹参素浓度为33.6μg／ml，原儿茶醛浓度为1.8μg／na的混合对照品溶液100μl加入同一塑料离心管中，按照样品测定项下方法测定，结果丹参素和原儿茶醛回收率分别为99.36％ (RSD为1.26％)和97.54％ (RSD为0.81％)，n=5。
2．8 提取条件 用TN-100B型托盘扭力天平精密称取5种不同产地的丹参药材各10g，用不锈钢刀切成0.5 cm×0.5cm小块，置于400ml烧杯中，加20倍双蒸水(即200m1)，浸泡40min后置烧杯于电炉上加热至沸腾，然后将烧杯移至三脚架上用乙醇灯文火煎煮1.5 h，双层纱布过滤药液，得到煎液1，再加20倍双蒸水，煎煮1.5 h，得到煎液2。两次煎液合并，加热浓缩至100 ml，移入150 ml玻璃瓶中，冰箱冷冻保存。5种丹参煎剂浓度均为0.1g／m。
2．9 样品测定 用1000μl加样器移取丹参煎液200μl至5ml塑料高速离心管中，加流动相3800μl， 电动混匀器混匀1min，以12000 r／min离心10min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，取5μl进样分析。
2．10 5种不同产地丹参煎液中丹参素和原儿茶醛含量测定结果(n=3)。用SPSS10．0统计软件进行方差分析显示，各产地丹参中丹参素含量比较，A0.05)；B>C(P>0.05)；其余之间比较，差异均具有显著性(P<0.01)。各产地丹参中原儿茶醛含量比较，差异均具有显著性(P<0.01)。
3 讨论
从上述结果可以看出，丹参素的含量(μg／m1)比较，卢氏野生丹参>洛阳丹参>卢氏家种丹参>蒲城丹参>陕南丹参；原儿茶醛的含量(μg／m1)比较，蒲城丹参>洛阳丹参>卢氏野生丹参>卢氏家种丹参>陕南丹参。在丹参素含量方面，洛阳丹参与卢氏野生丹参之间、蒲城丹参与陕南丹参之间比较，差异无统计学意义，其余产地丹参之间均存在统计学差异。在原儿茶醛的含量上，各产地丹参之间均存在统计学差异。所以在使用丹参药材时应注意鉴别其产地和品种。
由于丹参素和原儿茶醛均为水溶性成分，因此样品的提取采用水煎煮的方法。丹参素和原儿茶醛的结构中含有邻二酚羟基，易被氧化成苯醌而变色，水溶液均不稳定，用10g／L醋酸作溶剂配制对照品溶液，两成分含量3个星期内基本保持不变。丹参素和原儿茶醛均为具有酸性的物质，在中性流动相中由于存在着离解平衡，存在严重的拖尾现象，所以，目前测定上述两种物质大多在流动相中加入少量醋酸，抑制了酸性物质的离解，使这两种成分与其他物质很好分离。另外，本实验条件下，丹参素和原儿茶醛的最低检测限分别为10.5 ng和0.6 ng，两者分离完全(分离度：10.34)，保留时间适中(丹参素7.3 min，原儿茶醛13.7 min)，其他组分干扰小，样品提取及预处理方法简便，可作为丹参药材的质量控制标准。