石韦含量测定方法（绿原酸）

　　本品为水龙骨科植物庐山石韦Pyrrosia sheareri(Bak.) Ching、石韦Pyrrosia lingua(Thunb.) Farwell或有柄石韦Pyrrosia petiolosa(Christ)Ching 的干燥叶。
近十几年来，有关石韦及其制剂的含量测定方法报道较少，但其含量测定的指标成分――绿原酸的含量测定报道很多，主要有HPLC法、薄层扫描法、紫外分光光度法、毛细管电泳法。现分别简单介绍几种含量测定方法。

一、高效液相色谱法（HPLC）
⑴ 2005版药典石韦含量测定项：
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.5%磷酸溶液（11：89）为流动相；检测波长为326nm。理论板数按绿原酸峰计算应不得低于1000。
供试品溶液的制备：取本品粉末（过二号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定重量，超声处理（功率300W，频率25KHz）45分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
采用⑴中色谱条件的现举例采用的仪器（常用）。①崔岚采用Waters公司的Breeze系列高效液相色谱仪；Hypersi1 BDS C18色谱柱(5μm，4.6mm×100mm)； 流动相：乙腈-0.05％磷酸溶液(11.5：88.5)； 流速：1.0mL／min；检测波长：327nm； 柱温：30℃； 进样量20μL；灵敏度：0.02AUFS。绿原酸浓度在4.42～53.04μg／mL 之间与峰面积积分值呈良好的直线关系(r=0.9999)，平均加样回收率为104.60％，RSD 1.92％(n=5)。②2003年周会等采用HPLC测定爽咽茶中绿原酸的含量。Waters2690高效液相色谱仪；PDA996紫外检测器；KQ-250E超声波清洗器；UV-1601PC紫外可见分光光度计(日本岛津)。包谱柱：Lichrospher5-Cl8柱(4.6mm×250mm)。③美国1100型高效液相色谱仪；色谱柱：Kromacil C18柱(4.6mm×200mm，5μm)；④ GILSONN高效液相色谱仪.色谱柱：C18柱(4.6mm×200mm，5μm) ⑤岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10A紫外分析仪，CT0-10AS柱温箱，DGU-12A脱气机。色谱柱：Shim-pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)。⑥高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括2487双波长紫外检测器、1525型高压双泵：Hypersil BDS Cl8(150mm×4.6mm，5μm)。⑦仪器HP-1100高效液相色谱仪。含在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器、化学工作站： phenomenexR C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)。

⑵2002年钟小群等建立石韦药材中绿原酸的含量测定方法，用hypersil ODS-2柱，流动相为甲醇-乙腈-水(9.4：2.6：88)，醋酸调pH为3.O，检测波长325nm。此法绿原酸对照品线性关系良好(r =0.9990)，平均回收率达100.06％，相对标准偏差RSD=1.47％。实验仪器：Waters公司高效液相色谱仪，510泵，PDA紫外检测器。

⑶2004年李喜香等采用HPLC法测定附炎清灌注液中绿原酸的含量。SP-8800型高效液相色谱仪，SP-200型紫外检测仪，SP-4400数据处理仪。色谱柱： 国产淮阴精化C18柱(4.6×150 mm，5μm)；流动相：甲醇-水-甲酸(30：70：1)；流速：0.5 mL／min；柱温：室温；检测波长：327nm。样品处理：适量浓缩至稠膏状，水分次溶解，加入氯化钠、6 mol／L的盐酸调pH值=1，醋酸乙酯萃取，蒸干， 60％甲醇溶解。
⑷2004年莫海玲等采用HPLC法测定咽喉爽口服液绿原酸的含量。Waters公司高效液相色谱仪，2695泵，2487紫外检测器，色谱柱Waters ODS-2(4.6×256mm 5μm)，流动相：乙腈-0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(冰醋酸调pH值为3.O)(6：94)；流速：1.0mL/min，检测波长：326nm，柱温；30℃ 。
⑸杨月春等采用高效液相色谱法测定银黄口服液中绿原酸和黄芩甙的含量。Waters 501泵、484检测器、7725进样品、国产色谱工作站。色谱柱：Nova-Pack Cl8 200mm×4.6mm 4μm；流动相：0.05moL／L枸橼酸(pH=4．用三乙胺调)-乙腈(39：21)；检测波长：324nm。
⑹赵昕等采用高效液相色谱法测定豚草茎中绿原酸的含量。JASCO高效液相色谱仪，975型紫外检测器。色谱柱KYATECH(日本)ODS柱(4.6mm×25cm，5μm)；流动相：乙腈：水：冰乙酸(体积比)=10：90：5；检测波长：325nm

二、薄层扫描法
⑴1998年王和平等采用薄层扫描法测定复方金莲花口服液中绿原酸的含量。日奉岛津CS-930双波长薄层扫描仪。层析用聚酰胺薄膜，以36％醋酸溶液为展开剂，采用双波长反射锯齿扫描法，散射参数SX=7，λs=346nm λR=500nm。样品处理：适量样品用氯化氨调Ph至3，醋酸乙酯萃取。
⑵2001年曾经考采用薄层色谱法测定复方银花口服液中绿原酸含量。CS-9000双波长薄层扫描仪(日本岛津)；硅胶G1.5％硼酸板，以醋酸丁酯-甲酸-水-乙醇(1：l：l：0.2)上层液为展开剂。紫外光灯(365nm)下定位；荧光扫描λs =365nm，λR =450nm，SX=3，反射法线性扫描。样品处理：适量样品用水饱和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，用正丁醇饱和的水洗至无糖反应，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，过滤并转移至容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。吸取适量，水浴蒸干，残渣加少量的水溶解，通过SF2-PAKRC l8预柱，收集水洗脱液，加甲醇溶解。
⑶2002年原源等采用薄层扫描法测定健肝I号合剂中的绿原酸含量。CS-9OOO型双波长薄层扫描仪(日本岛津制作所)；展开剂：醋酸乙酯-甲酸-水(7：2.5：2.5，v／v)的上层溶液；紫外光灯(365nm)下定位；扫描条件：检测波长λs=324nm，参比波长λR=370nm，反射法锯齿扫描，宽度120mm。样品处理同药典。

三、紫外分光光度法
⑴1996年丁青龙等采用紫外分光光度法测定不同厂家银黄口服液中黄芩苷、绿原酸含量。日立U-3200分光光度计；752-紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)。绿原酸检测波长为318nm。样品处理：适量，依次用水和盐酸液稀释。
⑵2004年于华忠等采用紫外分光光度法测定不同品种忍冬及不同部位中绿原酸的含量。UV-160型紫外可见分光光度计(日本岛津)。检测波长为330nm。样品用80%乙醇超声提取。
也有报道绿原酸的吸收波长为325nm。

四、毛细管电泳法
2005年张兰等建立了毛细管电泳同时分离测定中药石韦中绿原酸、槲皮素含量的分析方法。采用柱端喷壁式三电极系统
的电化学检测方式，工作电极为0.5 mm碳圆盘电极；参比电极为Ag／AgCI；辅助电极为铂丝电极。以70cm(o．d.360μm，i.d. 25μm)的熔融石英毛细管为分离通道，在最佳电泳介质(pH=7.0，10.0mmol／L磷酸盐缓冲溶液)中，当分离电压为21kV时，两待测物质在8min内完全分离.在最佳分离、检测条件下，响应电流与浓度之间的线性关系良好，绿原酸、槲皮素的线性方程分别为：y=0.268+1.088、y=0.312x+0.822，相关系数大于0.999，绿原酸、槲皮素检测限分别达0.075μg／mL和0.020μg／mL。该方法具有良好的重现性，峰电流的RSD小于3.5。已成功的用于实际中药石韦和模拟血样中绿原酸、槲皮素的含量测定，结果令人满意。
2004年吕元琦等建立了毛细管电泳法分析复方鱼腥草片中绿原酸和槲皮素的方法。1229高效毛细管电泳仪(北京新技术研究所)配有固定波长紫外检测器；检测波长254nm，未涂层弹性石英毛细管柱(50cm×50μm，河北永年光导纤维厂)，工作电压l6kV，静压力进样(高度10cm，时间6 s)；背景电解质为pH 8.5的30mmol／L硼砂缓冲溶液(用0.2mol／L HAc和0.1 mol／LNaOH调pH)，使用前超声脱气10min；pHS-3B型酸度计(上海雷磁仪器厂)。毛细管使用前用0.10mol／LNaOH、水和pH8.5的30mmol／L硼砂缓冲溶液依次清洗10min，每次电泳后分别用0.10mol／LNaOH、水和pH 8.5的30mmnol／L硼砂缓冲溶液依次清洗2、3、5min。通过优化分离条件，15 min内实现了两种分析物质的良好分离,建立了CE分析复方鱼腥草片中绿原酸和槲皮素的方法，实际样品分析及加样回收实验结果表明该方法快速、准确、可靠。以绿原酸为含量测定指标的其它药材或制剂的含量测定同样也可以借鉴此方法。

有报道称，绿原酸紫外吸收波长为327nm，在复方中受重选峰的干扰的用紫外分光光度法不易获得准确数据，而用薄层双波长扫描法可将绿原酸有效分离进行测定，具有准确性高和干扰因素小的优点。由以上介绍可知，绿原酸的含量测定方法最常用的是HPLC法，薄层扫描法其次，HPLC法因操作简便、分离度高等将会在绿原酸的含量测定方面占主导地位。另外，新的分析方法，如毛细管电泳法也开始应用于绿原酸的含量测定，拓展了其含量测定方法。