建立了HPLC分析聚合酶链反应（PCR）产物的方法，探讨了梯度、流速、柱温等条件对相对分子质量参照物λ－DNA－HindⅢ分离的影响，NaCl以40～50mmol/min的梯度变化，流速为1mL/min时分离效果最佳。该法精密度和回收率高、线性良好，可用于PCR扩增条件优化时的相对定量分析。
关键词 高效液相色谱,聚合酶链反应
聚合酶链反应（PCR）是一种特异性DNA序列的体外酶促合成技术，应用TaqDNA聚合酶，在1～2h内，即可使DNA的扩增达到数百万倍，目前已广泛用于基因分析、突变体构建和DNA测序等领域。PCR反应后，必须对扩增产物进行检测，目前常用的琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析速度慢、自动化程度低、定量结果误差较大,而高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快、定量准确等优点。虽然近年来迅速发展的毛细管凝胶电泳对DNA具有更高的分辨率，已有大量用于PCR产物分析的报道，但HPLC在定量的准确性等方面仍具有优势。我们建立了HPLC分析PCR产物的方法，探讨了梯度、流速、柱温等各种条件对分离的影响，方法简便、快速，可用于PCR产物的相对定量分析。
1实验部分
1.1仪器、材料和主要试剂
HP1050高效液相色谱仪，BiotechsHS－97型基因扩增仪;雄性wistar大鼠（军事医学科学院动物中心）;DNA聚合酶（华美公司提供的Promaga产品）;λ-DNA－HindⅢ相对分子质量参照物（华美公司）;三羟甲氧基胺基甲烷（Tris）、氯化钠等国产分析纯试剂。
1.2β－actin的PCR
本实验以大鼠中性粒细胞为样本，按常规方法提取总RNA,逆转录为cDNA，然后进行PCR。4°C预变性3min后，按94°C35s、72°C60s、55°C50s进行32个循环，55°C延伸5～10min。取10μL反应产物，稀释5倍，10μL注入HPLC系统。
1.3HPLC分析条件
色谱柱：TSKgelDEAE-NPR柱（35mm×4.6mmi.d.）;
流动相：A.20mmol/LTris-HCl缓冲液，pH9.0，含0.25mol/LNaCl；B.20mmol/LTris－HCl缓冲液，pH9.0，含1.0mol/LNaCl;
线性梯度：20％B，10min，100％B,流速1.0mL/min;
检测波长：260nm。
2结果与讨论
2.1λ－DNA－HindⅢ相对分子质量参照物的HPLC分析
λ-DNA－HindⅢ是λ_DNA被HindⅢ彻底水解并经加热灭活的产物，在PCR产物分析中用作相对分子质量参照物，含有以下片段：125bp、564bp、2027bp、2034bp、4361bp、6557bp、9461bp和23130bp。我们首先对其进行了分离（图1），并探讨了各种条件对分离的影响。
2.1.1氯化钠梯度对分辨率的影响用NaCl0.4mol/L至1mol/L线性梯度，流速1.0mL/min，对λ－DNA－HindⅢ进行分离，改变梯度时间，使NaCl浓度的变化速度自15mmol/min到120mmol/min，考察相邻峰分辨率的变化，结果显示（图2），9000bp以上大片段的分辨率随梯度时间(tG)的增加而增加,而较低片段的分辨率在NaCl50mmol/min变化速度以下，几乎不受tG的影响，在此速度以上，随tG的缩短而降低，对于λ－DNA－HindⅢ的分析，NaCl以40～50mmol/min的梯度变化时，分离效果最佳。
2.1.2最佳流速的选择NaCl浓度以50mmol/min的变化速度从0.4mol/L到1.0mol/L进行梯度洗脱，改变流速对λ－DNA－HindⅢ进行分离，考察流速对分辨率的影响，结果表明，最佳流速为1mL/min。
2.1.3柱温对分离的影响从25°C到60°C逐渐增加柱温，观察温度对分离的影响。在25°C到45°C之间，温度的改变对分离的影响较小，45°C以上，随温度增加，分辨率明显降低。因此我们选择在室温条件下进行分离。
2.2PCR产物的定量分析
β－actin是横纹肌纤维和细胞细丝的蛋白质组分，常作为RT－PCR（逆转录PCR）扩增的内参照，以控制RNA提取、逆转录和PCR扩增各步骤的分析质量。用我们选定的条件对β－actinPCR产物的分离见图3。
2.2.1精密度和回收率取β－actin扩增产物，稀释5倍，每次进样10μL，测定分析的日内精密度和日间精密度（n=5）,日内相对标准偏差为1.06％,日间相对标准偏差为6.11％。取β-actin扩增产物10μL进样，计算出总峰面积。取下柱子，以一根空心管连接，重复进样，计算峰面积，用两个峰面积之差，算出回收率为93.2％。
2.2.2线性关系PCR产物用流动相稀释5倍，分别进样2、5、10、15、20μL，计算进样量与峰面积的线性关系，结果显示线性良好，Y=8.85X－0.639,r=0.9997。
2.2.3PCR扩增条件的优化PCR技术的敏感性较高，很容易受各种因素的影响，要得到准确的反应结果，必须根据不同的模板，摸索最适的引物、Mg离子浓度、dNTP浓度和循环数等条件。本法具有快速、简便的特点，特别适用于寻找最佳的扩增条件。我们用所建立的方法对22到40个循环的β-actinPCR产物进行了分析，确定32为最佳循环数。
展开全文