细菌内毒素检查方法

　　（一）概述本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集的反应机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素标准品系自大肠杆菌提取精制得到内毒素。以细菌内毒素国际标准品为基准物，以过协作标定，使标准品单位与国际标准品单位含义一致。用于标定细菌内毒素工作标准品和促裁鲎试剂灵敏度。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素标准品为基准物进行标定，确定基重量的相当效价。每1mg工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU，并具备均一性和稳定性的实验数据。效价测定方法如下：每批工作标准品至少取4支样品，使用同一批号鲎试剂、同1支标准品。每支工作标准品按重量、标准品按单位，分别用内毒素检查用水＊稀释制备一系列2倍稀释度的内毒素溶液，与鲎试剂反应，当4支工作标准品的反应终点的对数均值的标准差（S）小于0.365时，计算4支工作标准品的反应终点的几何平均值（以ng/mg表示）及标准品的反应终点值以（以EU／mg表示），按下式计算。

（二）试验准备本法所用的器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素常用250℃干烤30分钟或180℃干烤2小时，也可用其他适宜方法。试验操作过程应防止微生物的污染。

试验前需核对使用批号鲎试剂的灵敏度标示值，应符合规定。装量加入配带的鲎试剂溶剂。溶解后，为鲎试剂溶液，备用。

供试品的稀释：使用批号鲎试剂的灵敏度标示值小于供试品的内毒限量时，按下式计算，用内毒素检查用水＊将供试剂品稀释后进行检查。

供试品的稀释倍数＝X／λ

X：供试品的内毒素限量内毒素限量（EU／ml）

λ：供试品鲎度剂灵敏度标示值（EU／ml）

(三)检查装有0.1ml鲎试剂溶液的10×75mm试管（或0.1ml／支规格的鲎试剂原安瓿）4支，其中2支加入0.1ml供试品作为试品管，1支加入2λ内毒素工作标准品0.1ml作为阳性对照管，1支加入配带的鲎试剂溶液0.1ml作为阴性对照管。将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60±2分钟。保温过程和拿取试管要小心，避免因受到振动造成阴性结果。

（四）结果判断将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转1800时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性记录为（＋）凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一）。供试品2管如为（一），应认为符合规定，不再进行热原检查法（家兔法）试验。如2管均为（＋），应认为不符合规定。如2管中1管为（＋），1管为（一），按述方法另取4支供试品管复试，4管中有1管为（＋）即认为不符合规定。除正文另有规定外，有符合规定的供试品应再以热原检查法（家兔法）试验，并根据的结果判定。

供试品细菌内毒素的限量应符合各品种正文下的规定。

阳性对照为（一）或阴性对照为（＋），试验无效。

附灭菌注射用水、注射用水、氯化钠注射液、5％和10％葡萄糖注射液细菌内毒素检查。

【细菌内毒素】取本品，依法检查，供试品细菌内毒素的限量不应超过1EU／ml。如超过1EU／ml，需经热原检查法（家兔法）判定。

鲎试剂标准

本品为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品。

本品含能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原，凝固蛋白原其灵敏度以细菌内毒标准品或工作标准品测定，应为标示量的50％－200％。

（一）性状本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水生生理盐水中易溶。

（二）鉴别

1．取本品按装量加水溶解后，加茚三酮试液《中国药典1990年版》（二部附录162页）0.25ml，加热煮沸1－2分钟，显蓝色紫色。

2．取本品按装量加水溶解后，再加水适当稀释，照分光光度法《中国药典1990年版》（二部附录24页）测定，在270±1nm的波长处有单一吸收峰。

3．取本品按装量加入内毒检查用水溶解后，吸取0.1ml加入0.1ml细菌内毒素工作标准品或标准品50EU，混匀后，于37℃水浴中放置1小时，有凝胶形成。

（三）检查干燥失重：取本品约0.1在g ，在66℃减压干燥至恒得，减失重量不得过5％（中国药典1990年版二部附录55页）。

自身凝集：取本品4支，按装量加入配带的鲎试剂溶剂，溶解后，分别从每支取0.1ml，再分别加入配带的鲎试剂溶剂0.1ml，混匀后，于37±1℃水浴中放置4小时，不得形成凝胶，若有2管以上形成凝胶，判为不合格；若仅有1管形成凝胶，照同样方法，另取8支重复检查，8支均不得形成凝胶。

缓冲能力：任意取5％、10％葡萄糖注射液，氯化钠注射液无菌注射用水或注射用水适量，加稀盐酸调节pH使供试品溶液pH值为2.90-3.00，取此溶液适量与等量鲎试剂溶解液混匀，重复测定，pH值应为6.00-8.00。

（四）灵敏度测定预测：

1．取细菌内毒素工作标准品1支，按说明溶解燕稀稀释成1→8等比系列稀释液。

2．取同一批鲎试剂若干支，分别按标示量加入配带的试剂溶剂制成鲎试剂溶液。取10×75mm试管若干支，分别加入0.1 ml鲎试剂溶液，加入内毒素稀释液0.1 ml ，每一稀释液最少作2管，同时作2管阴性对照。轻轻振动上述试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃水浴中。保温60±2分钟观察结果，确定本批鲎试剂灵敏范围，2管阴性对照不得出现阳性结果。

测定：根据预测得到的灵敏范围，将细菌内毒素工作标准品以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个边疆稀释液，每一稀释液作4管，且其最高浓度的4管应均为阳性最低溶液的4管应均为阴性，同上述操作，记录反应结果，计算标准差（s）

X为4组反应终点的数对值,n为4

当s＜0.365时，按下式计算本批鲎试剂灵敏度（λ）

当s＜0.365时测定无效，应检查出现差异原因，并重新测定。

（五）用途用于细菌内毒素检查。

（六）规格（1）0.1ml；（2）0.5ml。

（七）贮藏遮光，在冷处保存。有效期暂定1年。

*系指其内毒素含量不超过0.006EU/ml的注射用水。