除少数体液经简单处理后直接测定外，通常在最后一步测定前要采取适当的样品制备，即进行分离、净化、浓集、必要时尚需对待测组分进行化学改性，为测定创造良好条件。
一、样品的制备要考虑：药物的理化性质、待测物的浓度范围、药物测定的目的、选用的生物体液和组织的类型、样品制备与分析技术的关系。
二、蛋白质的处理：是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药物时的最先处理步骤。
（一）加入沉淀剂和变性试剂：硫酸铵是经典的蛋白质沉淀剂，它与蛋白质分子竞争系统中水分子，而使蛋白质析出。阴离子型沉淀剂（三氯醋酸、高氯酸、钨酸、焦磷酸）与带电荷的蛋白质在氏于等电点的pH时形成不溶性盐；反之，阳离子型沉淀剂（含锌盐、铜盐）与蛋白质分子中带阴电荷的羧基，在高于蛋白质等电点时，形成不溶性盐。有关机制不十分清楚。
（二）加入可与水混合的有机溶剂：乙醇过量存在时，能使与蛋白结合状态的药物释放可将混合物离心，取上清液（含药），但这不能解决样品的净化问题。蛋白沉淀法对于与蛋白结合力强的药物的回收率较差。也有采用酸消化法(Acid digestion)使药物自蛋白结合处释出，但常导致药物的分解。
（三）组织的酶消化法：蛋白水解酶(Proteolytic enzyme)中的枯草菌溶素(Subtilisin Carlsberg)不仅可使组织酶解，且可使药物析出。优点：
1、因是在平稳条件下进行的，可避免某些药物在酸中水解及较高温度时降解；
2、可显著改善对蛋白结合率强的药物的回收率；
3、可用有机溶剂直接提取消化液而无乳化生成的危险；
4、在用HPLC时，无需再进行过多的净化操作。缺点是不适用于一些在高pH时易水解的药物。
三、提取：
（一）溶液的pH调节：最佳pH选择主要与药物的pKa值有关。pH与pKa相当时，50%的药物以非电离形式存在。碱性药物最佳pH值要高于pKa值1～2个pH单位；反之，则低1～2个单位。可使90%药物以非电离开形式存在，易为溶剂提取。而对于碱性很强的药物往往采用“离子对”技术进行提取和定量。体内酸性物质较多，在碱性条件下不会被萃取出来，故在pH值偏高的情况下进行提取较好。
（二）提取溶剂的极性：选好第一个提取溶剂可减少以后的净化操作，在液-液提取中多采用极性小的溶剂。加入少量醇类可克服极性小溶剂提取能力弱和减小药物在容器表面的吸附损失的不足。也有利用不同极性的混合溶剂来提取药物和净化脂肪酸类。
（三）提取技术：由于体液样品量少且药物含量低，一次分析的样品数量较多。与常量和微量分析相比，提取时通常不采用反复提取的方法，多半进行一次（至多二次）提取，在改变pH后，从有机相回提至水相也只进行一次。一般并不考虑“提尽药物”，测定含量时则应精确加入提取溶剂，提取液也要定量分出为避免进样时带来的误差，多采用提取前加入等量内标，以待测组分峰高（或峰面积）与内标峰高（或峰面积）之比对浓度作标准曲线。这样，即使在一系列操作过程中有微量损失，对比值影响也较小。混合时可在密塞情况下将试管平置于振荡器内振荡，振荡时间与强度视情况而定。可采用以“药物转入溶剂中量”与“混合时间”作图法，选取理想和符合实际的提取方式和时间。
（四）提取溶剂的蒸发：提取液常为数ml，往往不能直接供GC或HPLC测定，需采取浓集办法，常用真空蒸发（注意暴沸）或吹氮气流使溶剂挥散。
四、固相分离：
以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作，故有时这种方法又称为固相提取柱(Solid-phase extraction column)法。这类柱分两类：一种是阻留全部样品在柱上；一种则仅阻留药物及其相关物质。常用于填充柱的固相分离物质有氧化铝、活性碳、硅藻土、离子交换树脂及非离子型的树脂及凝胶等。在第一类柱中，常使用亲水性装填物，如硅藻土，可捕集全部样品。样品全部吸附在固相颗粒表面，形成一薄层，即使样品中含水也能如此。采用一种与水不相混溶的有机溶剂如氯乙烷倾入柱中，即可洗提药物。第二类柱则较有选择性，可装填疏水物或离子交换树脂，对药物及其相关物质进行滞留。常用的疏水物有活性碳、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶。这种疏水柱可从样品中吸附亲脂性药物，然后用有机溶剂将药物洗提分离。离子交换柱适用于高极性、可电离的药物。
五、利用分子大小进行分离―供血浆中游离药物的测定：
采用超速离心、平衡透析、限外过滤（超滤）以及凝胶过滤方法等。以上方法也可用于药物蛋白结合率的测定。
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