RP-HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量

目的：首次测定川牛膝中主要成分杯苋甾酮的含量。方法：采用反相高效液相色谱法。色谱柱YWG C18，流动相为甲醇-水(35∶65)，流速1 mL.min-1，检测波长243 nm。结果：杯苋甾酮在0.034～0.27 μg范围内线性良好。杯苋甾酮的平均加样回收率为98.35%，RSD为±1.6%(n＝5)。结论：本方法简便、快捷，重现性好。
关键词　川牛膝　杯苋甾酮　反相高效液相色谱法

中国药典(1995年版)收载的川牛膝为苋科植物川牛膝(Cyathula officinalis Kuan)的干燥根，主产于四川、云南、贵州等地。长期以来，由于川牛膝有效成分不明确，无合适的对照品，质量难以控制。近年研究报道，牛膝中的昆虫变态激素有促进蛋白质合成、抗血小板聚集等活性［1，2］，与川牛膝补肝肾、强筋骨功效相符。但在含量测定方面，未见报道。本文建立了HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量，以便控制药材质量。
1　仪器与试药
岛津LC-8A高效液相色谱仪，SPD-6AV紫外检测器，C-R6A数据处理机，Catalog 7125型进样器。
乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
对照品：自制，TLC及HPLC检测均为单峰。经过UV、IR、MS、?1H-NMR、13C-NMR、CD等测试鉴定为杯苋甾酮，见图1［3～5］，纯度为99.26%。
药材：采于地道产区四川雅安地区及乐山地区，栽培品种及购于成都、武汉、上海等地药材经鉴定均为Cyathula officinalis Kuan。
2　色谱条件
色谱柱：YWG C18不锈钢柱，4.6 mm×250 mm，5 μm(大连依利特科学仪器公司)；流动相：甲醇-水(35∶65)；流速：1 mL.min-1；检测波长：243 nm；柱温：35 ℃；检测灵敏度：0.01 AUFS。在本色谱条件下，对照品与样品色谱图见图2。

图1　杯苋甾酮与蜕皮甾酮的结构式
A.杯苋甾酮(Cyasterone)　B.蜕皮甾酮(Ecdysterone)

图2　川牛膝的HPLC图
A.杯苋甾酮　B.川牛膝药材
1.杯苋甾酮

3　测定条件
3.1　检测波长的选择　将杯苋甾酮在UV-2401 PC型(岛津)分光光度计上进行光谱扫描，在243 nm波长处有最大吸收，故选择此波长进行检测。
3.2　线性关系考察　精密称取杯苋甾酮对照品1.68 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，分别吸取2，4，8，12，16 μL，进样测定，以对照品的进样量X(μg)对峰面积积分值Y作图，得到一条直线。结果表明：杯苋甾酮在0.034～0.27 μg范围内线性关系良好，其回归方程为：

Y=-9.144×103+1.181×106X　r=0.999 9

3.3　精密度试验　精密吸取上述对照品溶液，连续进样5次(每次8 μL)进行测定，计算，RSD为1.3%。
3.4　重现性试验　取1号栽培品样品，按样品溶液制备方法同时制取5份供试溶液，各精密吸取4 μL进样，测量峰面积，测定结果的RSD为2.1%。
3.5　稳定性试验　对照品及样品溶液避强光放置，每隔2 h测定1次，结果表明在8 h内均保持稳定。
3.6　加样回收率试验　精密称取1号样品(表2)1.0 g，5份，加入一定量杯苋甾酮，按照样品溶液制备方法制得供试溶液，测定含量，以杯苋甾酮计算加样回收率，结果加样回收率为98.35%，RSD为±1.6%，n=5。
4　样品溶液制备方法考察
取生药粉末1 g(80 ℃，4 h，过20目筛)，按以下方法制成供试液。
方法1：置50 mL圆底烧瓶中，加甲醇20 mL，回流1 h，滤过，残渣用甲醇洗涤，合并滤液和洗涤液，用甲醇定容成10 mL。
方法2：置10 mL量瓶中，加甲醇8 mL，超声波提取1 h，取出，放冷，加入甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液作供试液。
方法3：置10 mL量瓶中，加甲醇至近刻度，室温浸泡2 h，时时振摇，定容成10 mL，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液作供试液。
以上3种方法制成的样品中杯苋甾酮含量见表1。

表1　不同提取方法样品中杯苋甾酮含量(n＝3)

方法
含量/%
RSD／％

1
0.061
4.7

2
0.034
1.5

3
0.020
2.3

结果表明，热回流法较其他方法提取完全。

5　样品含量测定
用上述色谱条件及样品溶液制备方法对栽培品川牛膝和商品川牛膝作含量测定，结果见表2。

表2　川牛膝中杯苋甾酮的含量(n=3)

样品
来源
采收时间
含量/%

1
天全县大河乡太阳村
1997.11
0.066

2
天全县大河乡小沟村
1997.11
0.074

3
天全县小河乡关家村
1997.10
0.072

4
天全县小河乡关家村
1997.11
0.070

5
宝兴县干阳沟
1997.11
0.066

6
宝兴县干阳沟
1997.11
0.022

7
汉源县药材公司
1997.11
0.062

8
金口河区永和镇胜利村
1997.11
0.048

9
金口河区永胜乡花瓷村
1997.11
0.057

10
成都华西附院
1998.10
0.088

11
成都中医药大学黉门附院
1998.10
0.042

12
成都骨科医院
1998.10
0.068

13
成都苏煜文门诊
1998.10
0.072

14
成都荷花池8厅4排36号
1999.1
0.061

15
成都荷花池5厅1排34号
1999.1
0.067

16
成都荷花池7厅7排43号
1999.1
0.023

17
湖北中医药研究院专家门诊
1999.1
0.082

18
湖北中医药研究院附属医院
1999.1
0.073

19
上海抗肿瘤药房
1999.5
0.072

20
上海益众国药号
1999.5
0.082

21
杭州下城区中医院
1999.5
0.081

22
杭州永康药店
1999.5
0.059

6　讨论
6.1　流动相曾采用乙腈-水(20∶80)，其图谱看似不错，但同一样品测出的杯苋甾酮含量较甲醇-水系统多2倍，表明杯苋甾酮与其他成分未分开。
6.2　曾有文献报道，川牛膝中含有0.057%的蜕皮甾酮［6］，根据我们对川牛膝的深入研究，有以下理由认为川牛膝含杯苋甾酮，不含蜕皮甾酮(图1)：(1)成分分离未得到蜕皮甾酮，但得到较多杯苋甾酮。(2)在正相TLC上，2者能完全分离，显色后显示不同颜色和Rf值，见图3。我们对栽培和市售的川牛膝均作过TLC鉴别，发现均含有杯苋甾酮，不含蜕皮甾酮。图3中斑点a含量很低，仅在少数药材样品中存在，因其Rf值在蜕皮甾酮附近，曾被怀疑为蜕皮甾酮，我们分离得到少量斑点a物质，经红外光谱鉴定，含有2个羰基峰，且显色后与杯苋甾酮颜色相同，故其结构应有别于含1个羰基的蜕皮甾酮而与杯苋甾酮类似。(3)反相HPLC对2者不能分离，图4，这也许是前人误认为川牛膝含蜕皮甾酮的根本原因。(4)川牛膝为苋科杯苋属植物，怀牛膝为苋科牛膝属植物，2种不同属植物含有不同侧链的甾体化合物是可以理解的。

图3　川牛膝与怀牛膝的TLC图
1.怀牛膝　2.蜕皮甾酮　3.杯苋甾酮　4.川牛膝
薄层板：硅胶G
展开剂：氯仿-甲醇(8∶1)
显色剂：10%硫酸乙醇溶液

图4　蜕皮甾酮与杯苋甾酮的HPLC图
A.蜕皮甾酮　B.蜕皮甾酮+杯苋甾酮
1.蜕皮甾酮　2.杯苋甾酮

6.3　曾有文章报道，从头花杯苋Cyathula capitata Moquin-Tandon(Amaranthaceae)分离得到杯苋甾酮C-25异构体，即异杯苋甾酮(Isocyasterone)［7］。本次分得的杯苋甾酮对照品的C-28和C-25位氢分别出现在δ 4.159和δ 2.444处，为十分相似的较规则的6重峰，C-28氢的偶合常数为6.4，15 Hz；C-25氢的偶合常数为6.8，18 Hz。表明2者与C-24氢均为反式关系。且与文献［5］的CD(圆二色谱图)完全一致。故确定为杯苋甾酮而非异杯苋甾酮。
本次从川牛膝中还得到β-谷甾醇、羟基杯苋甾酮和1个尚未完全鉴定的高级脂肪酸。