电泳技术在中药分析中的应用进展

ainuo 网络 2015-12-24 12:10:00

  中药是我国的国粹,但是中药有效成分的分析有其特殊的复杂性。首先是中药品种繁多,不同品种间活性成分的含量相差悬殊;其次中药中有效成分还受产地、栽培、生长环境和采收季节等多种因素的影响。传统的鉴别分析方法已影响到了我国中药事业的国际化发展。为加快我国中药的现代化和国际化进程,新的研究方法必须依赖和采用现代仪器技术。

目前用于中药成分分析的方法有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、超临界流体色谱法(SFC)、高速逆流色谱技术(HSCC),气相色谱与质谱联用,(GC-MS)技术、液相色谱与质谱联用(LC-MS)技术等。其中HPLC最常用。但用HPLC进行中药成分分析常遇到一些问题,一是分析时间长、分离效率低,即使采用梯度洗脱技术也难以使某些成分完全分离;二是由于中药成分复杂,色谱柱容易被污染,而且污染后难于清洗,使柱的使用寿命缩短,且难以再生;三是色谱柱上沉积的污染物,经常以杂质峰的形式出现;四是分析运营成本高;五是对于含极性成分较多的中药,其“指纹”的特征不强。

高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis HPCE)又称毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)是近十几年来发展很快的一种高效分离分析技术。它以高压电场为驱动力,毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术具有分离效率高、速度快、灵敏度高,所需样品少、溶剂消耗少、成本低、前处理简单、抗污染能力强、应用范围广等特点。下面简要介绍一下高效毛细管电泳在中药材鉴别中的应用。

1中药及其炮制品鉴定中的应用

许重远等 用酸性、碱性、中性3种提取液采取HPCE技术对生药狗脊、制狗脊及其混淆品黑狗脊进行检测,实验结果证明其电泳图谱中存在显著差异,并可利用酸性提取液的图谱将生狗脊与制狗脊加以鉴别。

2 种子类药材鉴定中的应用

陈振德等对国产榧属植物种子蛋白进行了HPCE分析,电泳图谱区分了榧子、云南榧子、巴山榧子、香榧子、九龙山榧子、长叶榧子、日本榧子等,差异明显,可作为中药榧子的鉴别方法之一。陈振德等还对酸枣仁及其混淆品同科植物滇枣仁(又称理枣仁)和枳鹤咏行HPCE法鉴别。从应用HPCE对酸枣仁及其混淆品酸枣仁蛋白多肽检测结果看,酸枣仁与其混淆品之间有明显的差异,可有效地加以区分;同时本法需要样品少,操作简单、重现性好,HPCE作为酸枣仁的鉴别方法被证明是科学的、可行的。胡平等对中药菟丝子(旋花科植物菟丝子Cuscuta chinensis Lam)及其混淆品金灯藤,南方菟丝子应用HPCE法进行了生药鉴别。实验表明,同属不同种菟丝子的碱溶性和酸溶性蛋白在成分和含量上均有显著差异。结果与运用扫描电镜和显微镜鉴别的结果一致,可有效鉴别菟丝子来源。婆罗子为多来源的生药,性状很难鉴别,张新等采用HPCE-聚类分析法对不同产地不同原植物的生药婆罗子进行了有效鉴别。贾江滨等对乌梅及其混淆品李子的蛋白多肽进行了HPCE法鉴别。结果发现在酸性、碱性和中性蛋白提取液中乌梅和李子的HPCE图谱都存在明显差异。宋贤丽等利用HPCE法鉴别了6种决明属的药用植物种子,分别采用毛细管区带电泳(CZE)和毛细管胶束电动色谱(MECC)两种模式来进行电泳;电压分别选择了20,22,25,30kV;在200,214,220,235,245,500nm处进行检测。不同来源钝叶决明的电泳结果显示,采集时间和地点的不同对峰数目和峰面积影响较小,因此利用CE鉴别决明类种子具有可行性。

3 根茎类药材鉴定中的应用

李玉琪等利用HPCE法以赤土茯苓苷为土茯苓的标志性成分,选择了毛细管胶束电动色谱(MECC)分离模式对土茯苓(百合科菝葜属植物光叶菝葜的干燥茎)及其6种混用品进行了鉴别。分析样品均为各药材粉末的醇提液经过0.45μm滤膜过滤后直接进样,10min即可完成。验证了高效毛血管电泳具有样品处理简单、操作简便、分析快速等特点。该方法用于赤土茯苓苷的含量测定,也得到了准确的结果,而且其检测限很低(0.4μg/ml)。侯连兵等对三七及其混淆品菊叶三七的蛋白多肽进行了HPCE法的鉴别,在酸性、碱性和中性提取液中三七及其混淆品都存在明显差异。

4 花、叶及果实类药材鉴定中的应用

西红花是名贵中药以鸢尾科番红花的柱头入药。红花为菊科植物,头状花序入药,有时充当番红花销售。马晓强等对西红花和红花及伪品萱草和黄花菜应用HPCE法对其水溶性成分进行了定性分析,西红花、红花、萱草和黄花菜四种“红花”的毛细管电泳图谱显示了很大程度的不同。该方法速度快、灵敏度高、重现性好,可作为红花类药材的定性鉴别方法。谢立等对龙眼肉及其混淆品荔枝肉的蛋白多肽应用HPCE法进行了鉴别。陈志良等 对宁夏枸杞和枸杞的果实蛋白应用HPCE法进行了鉴别,从检测结果看,两者在4.0-12.0min区间具有相同的主要特征吸收峰。同时,两者在3种提取液中又有各自的特征吸收峰,两者之间有明显的差异,可有效地加以区分。王寅等以HPCE法对不同属群大青叶药材的理化特征差异进行研究,结果表明异地栽培的不同属群大青叶酸性提取部位的化学成分及含量有显著差别,依据电泳图谱中特征峰的迁移时间和峰面积,能有效鉴别不同属群的大青叶药材。

5 中药制剂生产质量控制中的应用

中药制剂成分复杂,目前其质量控制的方法多是测定其中一种或几种指标成分的含量,但这种方法不能完全体现出中药制剂的整体质量,在尚不清楚全体化学成分的情况下,现代色谱、光谱、波谱、质谱等仪器分析所得物质群指纹图谱展现了这种可能性。目前指纹图谱已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效的手段。

许重远等建立了甘草栓中甘草酸、甘草次酸的HPCE法,为中药甘草制剂的质量控制提供新的检测方法。尹茶等建立了同时测定银翘解毒片中绿原酸甘草酸和甘草次酸的HPCE法,结果表明,HPCE能在10min内完成银翘解毒片中3种有效成分的测定,灵敏度高,适于中成药中多种有效成分的同时测定。史国兵等考察了四种不同柞蚕蛾提取物的九如天宝液与市售九如天宝液的HPCE指纹图谱的差异,认为图谱特征明显、专属性强,为鉴别该药物的真伪提供了科学依据。沉郁英等采用HPCE法测定了10批供试样品的HPCE指纹图谱,建立相关的栀子药材的指纹图谱,并对该方法学进行考察,结果符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)中有关》规定,可作为控制以含栀子等中药制剂的内在质量。梁统等用MECC测定了补骨胶囊中淫羊藿苷的含量,并比较了由SDS及脱氧胆酸钠分别组成的电泳缓冲液对分离淫羊藿及其复方制剂中淫羊藿苷的影响,结论为由于杂质对毛细管柱柱寿命无影响,分辨能力强,能较好地把淫羊藿苷与干扰物分离,精密度高,有机溶剂消耗少,测定成本低,在中药有效成分的分离检测中显示了较好前景。闫滨等测定了克心痛滴丸中阿魏酸的含量,结果表明HPCE法分离测定阿魏酸操作简便,进样量小,分离完全,峰形正常。线性范围较宽重现性好,为中药制剂中阿魏酸的质量控制提供了新的实验手段。并从电泳图谱发现,克心痛滴丸中各组分均有良好的基线分离,提示对于其他组分定量分析的可能性。陈勇川等在用HPCE法测定刺五加注射液中槲皮素的含量中,考察了缓冲液的PH值、浓度对样品分离的影响。结果发现,缓冲液PH为8.5时,运行缓冲液为50mmol/L硼酸-50mmol十二烷基磺酸钠缓冲液时,槲皮素有较好的分离效果,为刺五加注射液中有效化学成分的定量提供了一条新的途径。陈勇川等用HPCE法测定了八珍丸和八珍益母丸中芍药苷的含量,结果表明定量是准确有效的,与HPLC法测定结果基本一致。《中国药典》(2000年版)(一部)中将HPLC法作为八珍丸中芍药苷定量的方法,要求理论板数不低于 2000,而本实验中用HPCE法的理论板数可达到100000以上,分离效率大大高于HPLC法。经方法学考察,本法精密度高、稳定性和重现性好。于燕莉等 用HPCE法测定了痹痛宁贴剂中东莨菪碱及乌头碱的含量。由于生物碱类药物的碱性强,极性大,采用HPLC分析时,往往被色谱柱吸附太强,造成峰形不好,易拖尾。虽然可通过改善流动相介质取得一定效果,但常用的离子对试剂对色谱柱污染极大。其采用HPCE法测定痹痛宁贴剂中2种生物碱的含量,具有分离效果好,可不经富集直接检测,操作简便快速的优点,4分钟即可得到点用图谱。郭丹等 在利HPCE法测定生发灵酊中阿魏酸和大黄酸的含量时发现:毛细管易冲洗再生,可保持高效,使各成分的分离较佳,并通过研究揭示了缓冲液浓度和PH对分离具有重要影响,选择30mmol・L-1硼砂(pH8.2)为运行缓冲液。

6 结语

高效毛细管电泳以其高效、快速、简便且柱不易受污染而优于HPLC法,在中药有效成分的分离、定性定量、中药材鉴别等方面应用将越来越广泛,目前仍存在重现性较差、线性范围窄和灵敏度较低等缺陷。随着商品仪器经不断改进和完善,加上自动进样器的普遍使用,基本可以克服重现性差的缺陷,与常规HPLC法接近;灵敏度低可通过在柱预浓缩如场放大堆积效应,或经浓缩预处理如固相萃取等技术加以改善。此外,HPCE法可与其它进样技术如流动注射联用,不但可提高测定精度,而且能完成连续自动进样及在线分析,方便大批量样品的测定,或采用CE-MS、CE-NMR及CE-MS-MS的联用技术,充分利用HPCE的高分离效率和MS或NMR的高灵敏度与定性鉴定能力,快速完成众多复杂成分的分离与结构鉴定,将大大提高和拓宽了CE的性能和应用范围,更适用于中药复杂化学成分的分离与测定。相信在不久的将来,随着新型分离技术的应用,中药现代化的进程必取得辉煌成就。

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