抑制性消减杂交技术在对虾基因克隆中的应用

摘　要：抑制性消减杂交技术是一项筛选、分离未知差异表达基因的试验方法，该技术具有快速、简便、灵敏、特异、高效，所需起始样本量较少等优点。利用该技术构建对虾组织消减cDNA文库，鉴定差异表达相关基因及其表达特性。通过对对虾差异性表达的免疫相关基因、抗病基因及其他性状基因的了解，旨在为进一步研究对虾抗病机理奠定基础，为利用抗病基因进行抗病育种提供一个有效途径，为提高对虾的经济效益提供前景。

关键词：抑制性消减杂交；对虾；差异表达基因；cDNA文库

对虾病毒性疫病具有传播快、流行面广、死亡率高、防治困难等特点，且造成的经济损失非常巨大，严重制约对虾养殖业的健康发展。目前如何控制病毒性疫病的发生和流行，已成为对虾养殖业亟待解决的主要问题。选育养殖性能优良、具有抗病性的对虾新品种和对虾基因疫苗是解决病害问题最有效的手段。在传统的选育过程中能有效检测和发现部分对虾对病毒具有天然的抗性，这意味着对虾中存在着抗病基因或者与抗病有关的差异表达基因。克隆和鉴定出这些抗性基因，并指导育种实践，可提高培育抗病对虾新品种的效率和水平，从而迅速获得优质的抗病对虾新品种。然而，目前在对虾中尚未得到有效的抗病基因，而且人们对对虾感染病原后的免疫机制也缺乏深入的认识，这可能与虾类免疫基因与哺乳类相比较存在较大的差异有关。抑制性消减杂交(Suppressivesubtractivehybridization，SSH)技术是分离差异表达基因的有效方法之一，能以指数增长的方式富集稀有差异表达基因。该技术具有简便易行、特异性高、背景低、重复性好、能分离出丰度较低的特异性片段等特点，近年来已被广泛应用到差异基因克隆中。

1　抑制性消减杂交技术简介

1.1　SSH技术原理

SSH是以选择性的指数扩增不同丰度差异基因抑制性PCR为基础，由标准化测试cDNA单链和消减杂交共同建立起来的方法。所谓抑制性PCR是利用链内退火优于链间退火，使非目的序列片段两端的反向重复序列在退火时产生“平底锅样”互补结构，因此它不能被特异性的扩增而被抑制，从而达到选择性扩增目的基因而抑制非目的基因片段扩增的目的。抑制性消减杂交是将经限制性内切酶消化后的测试cDNA片段的5′末端接上不同的接头，然后将测试和驱动进行2次杂交，再利用抑制性PCR选择性扩增目的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增。该方法去除了测试组和驱动组之间的同源序列，再结合抑制性PCR扩增目的片段，结果显著增加了低丰度差异表达的cDNA的概率。

1.2　SSH技术基本过程

以对虾为例说明SSH的操作过程，首先，将染病对虾和正常SPF对虾的组织的mRNA样品反转录为cDNA，染病对虾的cDNA为测试组(tester)，正常的SPF对虾的cDNA为驱动(driver)，用同一种限制性内切酶RsaⅠ切割，产生平头末端片段，将测试(tester)分为2份，每份连接不同的接头，接头1(adaptor)和接头2(adaptor)，接头由一长链和一短链组成的平端双链DNA片段，5′端为无磷酸基，保证只有接头中的长链与cDNA的5′末端连接，接头1和接头2含有可识别的序列，以便于插入克隆载体和测序提供酶切位点；接着进行2次杂交，第1次杂交是在染病的对虾cDNA中加入过量的正常SPF对虾的cDNA，分别形成：a.单链片段，b.双链片段，c.tester和driver的同源双链片段，d.driver的单、双链片段。单链a中富集了大量的差异表达的基因。第2次消减杂交则是将杂交后的2份tester混合，再加入新制备的变性的driver，结果除了形成a、b、c、d外，还形成了一个新的双链e，则2次杂交富集了差异基因。然后进行两轮抑制性PCR扩增，PCR扩增前先将黏性末端补平，以利于退火，于反应体系中加入针对adaptor长序列外侧序列相同的引物进行第1次变性、退火，则a、d片段没有引物结合位点而不被扩增；b片段两端结有相同的接头，形成反向重复序列，不被扩增；c片段只有一端有引物结合位点，造成线性扩增；e片段2端结有接头1和2，有2个引物结合位点，可以指数扩增。第2次PCR扩增，加入与接头内侧序列相同的引物，则只有e片段连续扩增。最终获得大量的差异表达序列。利用adaptor上存在的酶切位点，插入适当的载体转化细菌，经蓝白斑筛选差异表达的cDNA片段的阳性克隆，通过cDNA序列分析，Northern杂交等方法鉴定。

1.3　SSH技术的优缺点

SSH技术的优点在于：①具有简单特异性，本法通过将连接不同接头的片段进行2次消减杂交和2轮抑制性PCR扩增，结果特异性的扩增了差别表达的cDNA片段，无需反复更换和移出接头，并且一次可分离到上百个差异基因，试验操作简单，假阳性率低；②高敏感性，经纯化的mRNA合成的cDNA片段被RsaⅠ酶切后，产生多个短的cDNA片段，某些稀少丰度表达的cDNA可能被捡出；③具有背景低、重复性高、所需起始样本少等特点。SSH的主要不足之处在于：①起始材料要求高，比较的2组基因之间不能存在太多的差异；②且对mRNA的纯度和浓度要求很高，mRNA的量需达到2μg以上；③筛选出来的克隆还存在部分的假阳性，需再经过Northern和RT-PCR技术加以验证。

2　抑制性消减杂交技术在对虾研究中的应用

2.1　在对虾免疫相关基因的研究

对控制和抗感染对虾患病的分子机制的了解有助于获得一个有效的治疗方法，特别是对对虾的免疫机制的了解可以提出控制疾病发生的发展战略，从而提高养虾业的经济效益。LorgerilJD等用SSH方法研究斑节对虾免疫相关基因，他们从非感染的对虾和弧菌感染后存活的对虾组织中提取mRNA进行消减杂交，试验根据感染时间的不同分为3个组，以确定早期和晚期RNA量的变化，它可能代表着对弧菌感染反应的不同导致基因表达的不同，并且可能涉及对虾免疫反应的产生过程。结果获得了部分的看家基因、260个ESTs和许多抗菌分子，同时也发现少量的PEN转录子，这些基因被认为是在颗粒细胞中持续表达，而且已经在南美白对虾和中国明对虾血细胞的EST中证明这些基因代表相对较高的免疫相关序列片段。这些结果有助于理解对虾的免疫耐受现象，并且为优良对虾的选育提供可靠的分子标记或者预防虾病的发生。HeN等利用SSH技术鉴定被微生物侵染的日本对虾血细胞中的基因，在注射热灭活微生物溶液的日本囊对虾和正常的日本囊对虾之间进行消减杂交文库的构建，随机挑取291个克隆测序，与GenBank数据库进行比较，发现其中71个克隆中有25个基因的表达增强，在虾上发现了8个新基因。在这个消减文库中最大量的基因是Kunitz型蛋白酶抑制剂。在虾上也发现了许多编码信号分子的基因，例如Ras相关的核蛋白(Ran)，生长因子受体结合蛋白(Grb)，转化生长因子-β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)受体作用蛋白、整合素结合蛋白和干扰素受体结合蛋白，它们可能具有调节机体的抗侵染能力。同时发现吞噬和胞饮所需的伴侣蛋白、蛋白酶体、抗氧化剂和肌动蛋白重组体的cDNA的表达水平也比未侵染的对虾的表达量高，这有利于理解对虾的免疫反应的发生。GrossPS等发现EST法结合cDNA文库法是研究对虾的免疫基因比较有效的方法，他们通过表达序列标签对比了凡纳滨对虾与中国明对虾的血细胞和肝胰腺的免疫基因，建立了4个cDNA文库，随机挑选了2045个克隆进行测序，发现268个ESTs与44个免疫功能基因有关，在血细胞文库中没有发现免疫功能的抗微生物多肽的ESTs，在肝胰腺中发现了大量的免疫功能的凝集素ESTs。dela VegaE等通过SSH技术研究了在高温、低氧或者低渗的情况下斑节对虾血细胞中免疫相关基因和转座子的不同表达情况，结果发现SSH的258个克隆的随机测序结果中存在176个不同的序列，其中有58个与公认序列具有高度的相似性。通过RT-PCR进一步的证实了外界因素调节不同基因的表达，由此可见，在外界刺激下基因被上调或者下调，这为研究对虾对外因影响的遗传反应提供了研究基础。

2.2　在对虾病毒性疾病及抗病相关基因的研究

在对虾的各种病原引起的疾病中，病毒病造成的损失最为惨重，寻找与抗病相关的基因有助于进一步研究对虾的抗病机理，为提高对虾的抗病性以及寻找具有高的免疫功能的新品种提供理论依据。南美白对虾养殖业中危害最为严重的病毒性疫病原主要有桃拉综合征病毒(Taurasyndrome virus，TSV)、传染性皮下和造血组织坏死征病毒(Infectious hypodermal andhaematopoietic necrosis virus， IHHNV)和白斑综合征病毒(White spot syndromevirus， WSSV)，这些病毒性的疫病造成了对虾的大量死亡和严重的经济损失。目前，对WSSV的研究较多，YangF等采用RT-PCR和cDNA序列分析，鉴定了部分的表达基因，而且对部分基因功能进行了研究。曾勇等在其基础上利用抑制性消减杂交技术研究了对虾白斑综合征病毒的部分表达基因，结果鉴定了5个WSSV基因，其中WSV184具有调控蛋白的结构特征(Cys2/Cys2型锌指)，WSV321和WSV322含跨膜结构，且存在可能的糖基化位点。同时根据已报道的WSSV基因序列设计引物，扩增WSV321和WSV322两个阅读框所处的cDNA的5′端片段和3′端片段，结果获得其全长，该mRNA存在polyA，并有加尾信号AATAAA,2个阅读框都没有自己的TATA盒，但都有病毒RNA聚合酶Ⅱ的结合位点CCAAT盒。该试验利用了抑制性消减杂交技术构建文库，该技术可以快速的区别用作增殖WSSV的模型动物鳌虾的免疫相关基因和WSSV的表达基因。但是他们也提出了该方法的缺点，虽然该方法富集了差异表达基因，但是一些基因被多次的检测，如WSSV的阅读框WSV294在该试验中被检测到19次之多；而且该方法无法预知多大的文库可以包含所有的差异基因，所以检测到的WSSV表达基因偏少。曾勇等在得到的正、反两个文库中可以看到一些基因的表达量上升，部分基因在遭受病毒侵袭后表达量明显下降。其他研究者们也得到了部分的研究结果。RouxMM等利用定量PCR技术发现南美蓝对虾在感染WSSV后，感染早期宿主试图清除感染的病毒，而提高了酚氧化酶原基因的表达，随着感染的进一步进行，病毒不断地复制，抑制了免疫系统的作用，导致酚氧化酶原基因的下调，酚氧化酶原受丝氨酸蛋白酶的活化。同时，曾勇等和RouxM M等也都证明了对虾感染WSSV后体内的丝氨酸蛋白酶抑制物表达活性增高。WangB等不但建立了感染WSSV和非感染WSSV的中国明对虾的消减文库，而且还发现免疫相关蛋白热休克蛋白(HSP70和HSP90)、海藻糖磷酸合成酶(trehalosephosphate synthase，TPS)、泛素C在感染WSSV的对虾中的表达被上调；肌球蛋白LC2、ATP合成酶A链和精氨酸激酶在对虾感染WSSV后被下调；而肌动蛋白、延伸因子和微管蛋白等看家基因表达不稳定，因此当对虾感染WSSV时，这些基因不适合作为半定量RT-PCR永久的评价指标。他们提出在这种情况下磷酸丙糖异构酶(Troisephosphateisomerase，TPI)是理想的候选内参。研究者们在对虾的抗病性状基因方面也进行了大量的研究，发现了一些抗性基因。HeN等通过抑制性消减杂交(SSH)和示差杂交(differential hybridization，DH)揭示抗WSSV对虾中多种基因的不同表达情况，cDNA的序列分析发现30个基因在抗病毒过程中起着重要作用，在对虾中发现的22个新基因，干扰素样蛋白(interferon-likeprotein， IntLP)和(2′-5′)oligo(A)合成酶样蛋白作为抗病毒因子在抗病毒对虾中表达增强，而且通过细胞毒性试验证实了IntLP的非特异性抗病毒活性。在抗病毒对虾中氧化还原因子(NADH脱氢酶、谷光甘肽过氧化物酶和转录因子AP-1前体)、血浆防御蛋白(C型凝集素和层粘连蛋白样蛋白)和控制翻译的肿瘤蛋白(translationcontrolled tumor protein， TCTP)的高度表达暗示了它们是参与抗病毒过程的必需组成成分。PanD等首次发现了GTP酶参与信号转导以抵御病毒侵袭，在构建的消减文库中表达较多的基因是β-GBP和血青素，在感染的对虾中凝集素、铁蛋白、加氧酶和壳多糖酶的表达量比正常对虾的表达量高。ZhaoZY等也利用SSH方法构建对虾的抗WSSV的消减文库，获得了一些在抗WSS病毒过程中高水平表达的编码凋亡相关蛋白和抗氧化酶基因，并且在抗病对虾上获得了5个被上调的基因，如漆酶、羧肽酶B、H(＋)－转运ATP合成酶、Acyl-ConA结合蛋白(Acyl-ConAbinding protein， ACBP)和皮质颗粒蛋白LDL受体。

2.3　在对虾其他方面的研究

SSH不仅用于研究免疫基因和抗病基因之间的比较，而且在其他方面也是一种高效灵敏的鉴定差异表达序列的方法。ZhangZ等为了鉴定对虾的卵子发生过程中涉及的基因，通过SSH富集探针法构建了日本囊对虾的卵巢的cDNA文库。结果发现了对虾的核糖体蛋白L24(shrimpribosomal protein L24，srpL24)在日本囊对虾的卵巢和精子中的表达量不同。通过RT-PCR分析验证了不同器官中srpL24mRNA的相对含量，结果发现在卵巢的含量远远大于睾丸、肝胰腺、肌肉和眼睛中的表达量。这暗示了在卵巢中srpL24的高度表达对卵子发生具有重要的作用。GriffittR J等通过普通分子生物学技术、SSH和半定量RT-PCR检测3种不同的异生素、氟虫氰(fipronil，FP)、硫丹(endosulfan， ES)、镉(cadmium，Cd)对玻璃虾基因表达情况的影响。将对虾在半数致死浓度LC50条件下作用96h进行攻毒试验，结果通过SSH法建立了FP作用组和对照组中存活的对虾的基因组文库；对此文库克隆测序发现42个上调基因，47个下调基因；通过半定量RT-PCR检测受侵袭基因的亚型，以验证对虾对FP、ES和Cd的不同反应性，结果发现2个基因明显变化，即在3种异生物的作用下，谷胱甘肽过氧化物酶被上调，然而组织蛋白酶B对FP和ES有强烈的反应性，但是对Cd没有反应。O-甲基转移酶(O-methyltransferase，OMT)在动物和植物的不同器官中都存在，并且对生长、发育、繁殖和抗病等方面起着重要的作用，同时也发现其与人类的感情和疾病相关。Li DX等克隆了中国对虾的OMT基因并研究了其表达情况，通过SSH和cDNA方法克隆了感染细菌的中国对虾的血细胞中的OMT基因，结果发现944bp全长cDNA中包括一个编码221个氨基酸的OMT蛋白的单链666 bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)，分子质量是24 572.06 ku和10个磷酸化位点。Northernblot和原位杂交分析OMT在正常对虾和细菌感染的对虾的血细胞、心、肝胰腺、胃、腮、肠和卵巢中都有表达。然而，在感染的对虾的肝胰腺和胃中OMT的转录被上调。

3　展望

SSH是目前研究差异表达基因最为有效的方法之一，其具有快速、简便、灵敏、特异、高效、所需起始样本量较少等优点。利用SSH技术与cDNA微阵列技术，Northernblot，RT-PCR相结合的方法筛选与克隆出差异表达的免疫相关基因、病毒性疾病相关基因、生长性状相关和应激相关基因，对这些基因结构和生物学功能的深入研究，对虾病的防治和提高生长速度具有重要的意义。分离和克隆虾的免疫基因、抗病基因和生长基因，阐明抗病相关基因和生长性状的表达调控规律，为选育抗病力强、生长速度快的对虾新品种提供理论基础。