水产动物益生菌研究进展

摘　要：益生菌是指能够在生物体内存活，对宿主的生命健康有益的一类微生物。益生菌的应用是对水产养殖业现存问题十分有效的解决途径之一。目前已有报道的水产益生菌有乳酸菌属、双歧杆菌属、弧菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌、硝化菌、光合菌等。乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等已作为饵料添加剂应用于水产动物，起到很好的防治疾病和增进健康的作用；光合细菌对水质改良的作用十分显著，已在美国、东南亚等地得到广泛应用。益生菌制剂在将来很有可能成为抗生素的替代品，有着较好的发展前景。论文就其种类、作用机理、应用等方面做一简述。

关键词：益生菌；水产；现状；前景

抗生素的发现促进了人类医学的巨大进步，大量的抗生素被广泛应用，使动物养殖业不断受益，尤其是水产养殖业。在药物和技术不断革新的基础上，高密度、集约化、规模化、工厂化的养殖模式日趋成熟。但随之而来的病害大量传播、抗生素肆意滥用、养殖环境恶化、病原耐药性增强、养殖动物药物残留等问题也日益成为人们所关注的热点。

当前的水产养殖业在相当广阔的领域里都需要引进先进的生物技术，益生菌的应用则是一种对上述水产养殖业现存问题十分有效的解决途径之一。许多学者已经开始了该项目的研究，并取得了一定成果。

益生菌的研究为水产养殖业朝着绿色健康养殖的方向发展提供了理论依据，为解决当前水产养殖中病害大量传播、抗生素肆意滥用、养殖环境恶化、病原耐药性加强、养殖动物药物残留等问题奠定了一定的基础，是水产养殖中的一门新学科。

1　概念

一般认为，益生菌是指能够在生物(主要是人和动物)体内存活，对宿主的生命健康有益的一类微生物，一般把益生菌活菌制剂或含有微生物培养物的微生物制剂称作益生素。综合目前文献的报道，大多数益生菌的益生作用主要体现在防治消化道疾病、帮助消化吸收和刺激免疫系统三个方面。但对水产动物而言，益生菌的概念不仅于此，还包括能在养殖水体中存活，并能改良水质的有益菌类，包括乳酸菌属、双歧杆菌属、弧菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌、硝化菌、光合菌等。

2　研究现状

2.1　益生菌的种类

2.1.1　作用于水产动物的益生菌　作用于水产动物的益生菌种类见表1。

2.1.2　作用于养殖水体的益生菌　应用于养殖水体上的益生菌主要有两大类：①复合制剂，如美菌方、复合型活性生物净水剂等，主要由硝化和反硝化细菌、乳酸杆菌、枯草杆菌、双歧杆菌、假单胞菌、酵母菌、粪链球菌等菌株组成；②单一制剂，如光合细菌(Photosyntheticbacteria)、乳酸菌(Lactic acid bacteria)、酵母菌(Yeast)、中间气单胞菌(Aeromonasmedia)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、乳酸杆菌(Lactobacillus、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、溶藻胶弧菌(Vibrioalginolyticus)、噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)等。

2.2　作用机理

2.2.1　对养殖水体的作用　益生菌可以直接吸收或降解水中的有机物质或有毒物质，改善养殖水体的水环境。当光合细菌进入水体后，能迅速消除水中的氨氮、硫化氢、有机酸等有害物质，改善水质，平衡酸碱度。当化能异养有益菌进入水体后，发挥其氧化、氨化、硝化、反硝化、解磷、硫化、固氮等作用，把养殖动物的排泄物、残饵、浮游生物残体等有机物迅速分解为二氧化碳、硝酸盐、磷酸盐等，提供营养，促进单胞藻类的繁殖，同时自身迅速繁殖形成优势菌，从而抑制病原微生物的生长。

表1　益生菌的主要类型

Table1　Probiotic bacteria reported

2.2.3　竞争抑制　竞争抑制是益生菌的重要作用机制，也是微生态理论的主要观点。在水产动物体内，益生菌对病害菌的竞争性抑制，大致可分为占位抑制与营养抑制。在益生菌所有的生物效应中，与病害菌竞争附着点，可能是益生菌进入体内后发挥的第一个作用，通过对体内固定位点的竞争，使益生菌自身在体内占到优势，降低病害菌的数量和密度，起到防病的作用。有研究表明，益生菌分泌物的功能之一是抑制病害菌的固着能力，从而使自身在竞争固着位点时处于有利地位。然而，竞争不仅仅使病害菌数量减少，在某些情况下会出现“自我抑制”，即在益生菌的有益作用得到保证的前提下，在竞争中益生菌本身数量下降的速度反而要高于病害菌。GibsonLF等在关于牡蛎幼体抗病的研究报告中证实了这一点，但确切机理目前仍不清楚。当饲料中营养素产生缺乏时，益生菌与病害菌之间竞争利用有限的营养素，便也成为相互抑制的重要方面。益生菌通过更有效地利用有限的营养素，而导致病原菌营养缺乏，并以此使自身在竞争中取得胜利。

2.2.4　对水产动物免疫系统的影响　益生菌的作用机制除了直接的抑菌作用之外，还有其他的作用，那就是对远离消化道的免疫系统的影响。它提示着益生菌与抗生素的重大差异，并成为替代抗生素的一个重要理由。在陆生动物中所进行的一系列试验表明，动物体内的益生菌群的存在可以增强动物自身的免疫力，其免疫指标如巨噬细胞、免疫球蛋白、抗体等都与益生菌群有着密切的联系。水产动物也有研究报道了益生菌与其免疫力的关系。

2.2.5　营养作用　益生菌的营养作用确实存在，而且能在生产上产生一定的效果，因此，在探讨益生菌的作用机理，有必要提及益生菌的营养作用。水产动物体内的益生菌除了本身可以帮助动物对食物进行消化，提高饲料的利用效率之外，其本身也往往含有某些营养物质，如酵母菌、光合细菌等含有丰富的菌体蛋白和多种维生素等微量营养物质，可以供给动物生长需要。虽然益生菌的作用更多在于其对体内微生态的调节，并改善宿主动物的健康状况，但它的营养作用也是值得注意的。

2.2.6　其他作用机制的研究　除了以上这几方面的机制之外，也有一些研究者指出，益生菌可能存在其它作用机制。Gatesoupe FJ等综合了近几年来该方面的研究，认为铁在益生菌发挥作用过程中起着一定的辅助功能。益生菌的抑菌效果，在某种程度上受铁载体(siderophores)的调节。GramL等的研究也得出了类似的结论。另外，Stutz MW等在体外对乳酸菌作用的机理进行的研究发现，乳酸菌抗菌的惟一机理是它产酸后造成的低pH环境，使病原菌灭亡，但并未观察到乳酸菌过氧化氢以及蛋白水解酶发挥作用，也未观察到其与病原菌的营养竞争作用。

2.3　益生菌的筛选与鉴定

益生菌的筛选与鉴定，一直是制约益生菌研究进行的重要因素。目前，对于益生菌的筛选往往通过采集大量不同菌株，然后在体外进行选择性培养或进行抗菌试验。在这种情况下，研究优良的选择性培养基就显得格外重要，这方面的研究早已开展，并在GatesoupeF J等的综述中进行了总结，详细列出了乳酸菌选择性培养基的种种原则与方法。 Sugita H等从7种近海鱼类肠道中分离出1055株菌株进行抗菌试验，从中选择出优良的益生菌株芽孢杆菌。Riquelme C等在不同的水产动物中也进行了相似的试验。

近年来，随着分子生物学和各种新技术的不断兴起和应用，在水产动物益生菌筛选与鉴定的研究方面，也出现了各种新的技术和手段。VandenbergheJ等对凡纳滨对虾养殖中常见的Vibroharveyi菌株进行了全序列的AFLP指纹图谱分析，以获取确切的遗传特征。Spanggard等同时采用传统的平板培养筛选法与16 SrRNA测序法对虹鳟肠道菌群进行鉴别，结果证明两种方法所得结果有相当的一致性。

3　应用

3.1　在水产动物上的应用

3.1.1　作为饵料添加剂，抑制有害微生物　益生菌能调节水产动物体内的微生态平衡，增强新陈代谢，促进生长发育，从而起到防治疾病和增进健康的作用。应用较多的是乳酸菌(Lacticacidbacteria)、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母菌(Yeast)等，如温崇庆等筛选出了两株对虾益生芽孢杆菌；林煜研究了A40209CDC4(枯草芽孢杆Bacilluubtilis)和A31009NA(少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobil)对水质和饲料添加有益生效果。

乳酸菌如果在鱼肠道系统大量定植，可以抵抗革兰氏阴性致病菌，增强机体抗感染能力，增加肠黏膜的免疫调节活性，促进鱼类生长，能够提高抗病力。

芽孢杆菌作为于饲料添加剂的芽孢杆菌，是一种需氧的非致病菌。在肠道微生物群落中以内孢子形式存在，能使肠道内pH下降，NH3浓度降低，促进淀粉、纤维素等的分解，是一种耐酸、耐盐、耐高温和耐挤压的比较稳定的益生菌。在轮虫培养基中加入芽孢杆菌IP5832菌株的孢子，结果发现，轮虫中弧菌属(Vibrionaceae)的组成下降，用孢子培养的轮虫喂养的大菱鲆的幼体，在10d时，其平均重量显著增加。用弧菌(Vibrio sp.) 侵染轮虫，各组大菱鲆幼体均出现死亡现象，但用孢子培养的轮虫喂养的大菱鲆在10d时的平均死亡率为31%，明显高于对照组的10%存活率。

酵母菌是喜生长于偏酸性环境的需氧菌，可在肠道内大量繁殖。水产养殖中常使用的主要有假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、隐球酵母属(Cryptococcus)的酵母菌以及酿造酵母(Brewersyeast)和面包酵母(Baker ,yeast)等。酵母菌含有动物所必需的多种维生素、微量元素、烟酸、叶酸、胆碱和丰富的蛋白质，可以增加消化酶的活性，并能增加非特异性免疫系统的活性，如袁成玉等研究了微生态制剂对幼刺参生长及消化酶活性的影响。酿酒酵母7764可以抑制杀鲑气单胞菌的生长，酵母菌与乳酸菌共用，可提高印度对虾(Penaeusindicus)幼苗的生长率、存活率。在对虾饵料中用饲料酵母替代部分鱼粉的养殖试验结果表明，试验组对虾的成活率和产量有所提高；饲料系数也有所下降，对虾的发病率也比较低。

此外，利用双歧杆菌制剂抑制革兰氏阴性菌，减少肠杆菌细胞壁内毒素进入鱼体，从而保护肝脏，治疗鲤鱼暴发性肝炎病取得较好的疗效。许多产生含铁细胞的荧光假单胞菌可作为益生菌，荧光假单胞菌能排斥气单胞菌的侵染，并能降低感染弧菌的鳟鱼的死亡率。荧光假单胞菌(Pseudononasfluorescens) AH12对致病菌有抑制作用。用添加鱼类肠道菌群活细胞、肠微球菌(Micrococcosintestoinali sp.)、贝内克菌(Benecken Campbell)、非OI群弧菌(non-OI groupVibrio cholerae)的饲料，可以减少鳗由于寒冷或从盐水区溯河进入淡水区而致的生态失调病的发生，降低死亡率。

3.1.2　强化饲料的营养，提高机体免疫力　益生菌可以作为水产动物的免疫刺激剂和免疫佐剂。将光合细菌拌入饵料，投喂中国对虾22d后发现虾体PO、SOD、溶菌和抗菌活力分别比对照组高，血细胞数目明显高出对照组。采用有益芽孢杆菌制成微生物添加剂，对鲤鱼的生长和免疫功能进行试验，结果显示，试验组鲤鱼免疫器官胸腺、脾脏生长发育较对照组迅速、成熟快，电镜观察鲤鱼免疫器官内T、B淋巴细胞较对照组成熟快、数量增多、产生抗体增多，免疫功能增强。RengpipatS等对投喂了益生菌株 Bacillus S11的黑虎虾的研究表明，益生菌的投喂，明显提高了虾的吞噬细胞的水平，也提高了酚氧化酶与抗菌物质的活性，这使得实验虾在遭受病原菌的侵袭时，存活率大大高于对照组的虾。益生菌通过促进免疫细胞活性，增强体液和激素水平来提高动物机体的免疫力。华雪铭等研究发现多糖和益生菌对免疫功能低下的暗纹东方纯具有免疫调节作用，并能改善幼体的消化作用，提高生长效率；王福强等研究了产蛋白酶益生菌对牙鲆幼鱼生长有促进作用。

3.2　在养殖水体上的应用

光合细菌具有光合作用能力，能直接消耗利用水中有机物、氨氮，还可利用硫化氢，并可通过反硝化作用除去水中的亚硝酸氮，具有很高的水质净化能力，从而改善水质，促进水产动物生长。从1965年起，日本就开展了光合细菌在水产养殖中的应用研究，并取得了很大成功，研究成果已在日本、东南亚和我国台湾等地得到了普遍应用。李卓佳等研究了细基江蓠繁枝变种Gracilarlatenuistipitata var.1iui与益生菌(光合细菌 Rhodopseudomoans ca psulata和芽孢杆菌Bacillus lichenifirmis)24h内对集约化对虾养殖废水的协同净化作用。硝化细菌能够加速封闭的海水养殖系统的改善，使硝化作用建立的时间缩短30%。在半封闭的循环系统中，接种一种活跃的硝化细菌液体培养物后，硝化的生物过滤器的建立时间从21d～28 d缩短至10d。所以当发现池塘中氨或者亚硝酸盐的含量增加时，可以往水中添加硝化细菌。在养殖牙鲆生产中使用自净式养殖槽，其基本原理就是在池底增设生物净化床，代谢产物被异养细菌分解后，所得氨态氮再被硝化细菌转化为硝酸氮。在水产养殖中用于水质净化的制剂由枯草杆菌、绿脓杆菌、史都哲氏假单胞菌、荧光假单胞菌、亚硝酸单胞菌、硝酸菌等微生物组成。使用后能迅速繁殖而成为优势菌，并以其活跃和丰富的酶系统将养殖池塘中多余的残饵、生物排泄物、动植物尸体及其他有机污染物分解为二氧化碳和水，从而达到减轻污染，净化水质，减少病害的目的，在美国、东南亚等地得到广泛应用。

在养殖水体中使用益生菌，能杀死或抑制病原微生物。光合细菌除了能改善养殖生态环境外，还对弧菌有一定的抑制作用，通过抑制和降低池中弧菌的数量，来预防细菌性疾病的发生。将芽孢杆菌制剂应用于成虾养殖，成功地改善了水体和底泥中的细菌组成，发光弧菌的数目明显减少，有效地控制了弧菌病的发生。蛭弧菌对水气单胞菌有较强的裂解和净化作用，对水中氨氮有一定的降解作用。

4　存在问题及发展前景

水产动物益生菌在短短十多年时间内，以迅猛的势头发展并应用于水产养殖业，起到了不可估量的作用，但对益生菌的研究及应用仍存在着许多问题。主要有：益生菌在水产动物体内的作用机理仍存在很多困惑；益生菌在水产动物体内的定植和更替的机理仍然模糊不清；对于益生菌的筛选与鉴定手段落后，效率相对低下；益生菌种缺乏，目前已确认可作为生产用的益生菌只有乳酸杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌等少数菌种；活菌制剂在饲料加工、运输工程中容易失活；生产用菌株往往生长缓慢，很难在与病害菌竞争过程中取得优势；菌株的抗药性问题，已出现用有抗药性的菌株作为益生菌的现象；益生菌的安全性问题也是一个不容忽视的问题。

随着分子生物学的广泛应用，应当加强相关基础研究，研究新的加工工艺，从细胞、微生物、基因等多个角度开展研究。借鉴人和畜禽益生菌研究的新成果，开拓思路，找到新的研究线索。对于安全性、抗药性问题必须引起足够重视，加强对抗药性菌株和菌株安全性的检测，严防此类益生菌的使用，使益生菌这类产品更快、更好的为水产业服务。

益生菌能促进水产动物的生长和生长性能，降低生产成本，提高产品质量，减少疾病的发生，改善环境的污染是益生菌能够提供的各项优势。益生菌作为饲料添加剂，使我们可利用其特殊代谢能力，解决当今饲料及养殖业的许多难题。它对产品无毒副作用、无残留和抗药性，不污染环境，提高了水产动物生产性能和健康水平，能够获得较好的社会效益和经济效益。因此，益生菌制剂在将来很有可能成为抗生素的替代品，有着较好的发展前景。