鸭疫里默氏菌研究进展

摘　要：鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌引起的一种重要的鸭细菌病。由于该病分布的广泛性以及引起鸭的高死亡率、发育迟缓和淘汰率增加，给养鸭业造成巨大的经济损失。所以，对鸭疫里默氏菌进行深入研究，以便预防和控制、乃至最终消灭本病，有着重要的经济意义。论文从血清型、诊断方法、疫苗等方面概述了近年来鸭疫里默氏菌研究进展。

关键词：鸭疫里默氏菌；血清型；疫苗

鸭疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)是一种革兰氏阴性、无运动力、不形成芽孢的球杆状细菌，主要侵害家鸭，也可感染鹅、火鸡、鸡等家禽，亦有报道从野禽和家养猪中分离到本菌。由该菌引起的鸭疫里默氏菌病(又名新鸭病，鸭疫综合征，鸭传染性浆膜炎和鸭败血症等)是一种高致病性、接触性传染病，主要引起感染鸭急性或慢性败血症、纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎和干酪性输卵管炎，还可出现结膜炎、关节炎以及生长发育迟缓等症状。

1　RA的分类地位

从最初发现RA至今，其分类几经变更。直至SegerP等通过研究rRNA顺反子相似性，将其列为同源群的单独一个rRNA分支，即属于rRNA总科中的一个rRNA同源群。1997年，Subramaniam等研究了4株RA编码的16SrRNA的rrs基因，通过DNA序列分析进一步证实了本菌的系统发育位置，即属于rRNA总科中的黄杆菌科的一个独立的rRNA分支。为纪念Riemer，遂将其命名为鸭疫里默氏菌属(Riemerellaanatipestifergen.nov)，其典型菌株是LMG11054、ATCC11845、MCCM0568和CCUG14215。这一更名得到了世界其他国家学者的认可，并被国际权威性专业期刊如Aviandisease、Avian Pathology所引用。

2　血清型

RA的血清型众多，过去不同国家采用不同的分型系统，结果同一血清型往往有不同的名称，为避免这种混乱，后来统一采用美国的阿拉伯数字分型系统。世界上报道的公认的RA血清型共有21个，即血清1型～21型。PathanasopHonP等利用HaeⅢ酶切分析了80株RA分离株的16 SrRNA的rrn基因的PCR扩增片段，根据HaeⅢ酶切图谱的差异，认为K-670/89不适合做20型的标准株，建议以698/95代替之。程安春等从不同代次的5日龄～90日龄患有典型鸭传染性浆膜炎的病死鸭中分离到4个不属于1型～21型的新的抗原型，分别命名为22、23、24、25型。

1979年，Sandhu等认为RA各血清型之间不发生交叉反应。但张大丙等发现2型与17型在玻片凝集试验中存在明显的双向交叉反应，在试管凝集试验中表现为单向低度交叉反应。张大丙等还证实6型、12型与16型之间存在交叉反应。至于其他血清型RA是否存在交叉反应以及交叉反应程度的强弱，还有待于进一步研究。

3　诊断

典型的RA感染可根据流行病学特点、临床症状和病理变化做出初步诊断，但确诊还需进行实验室诊断。对RA的实验室诊断技术包括病变器官涂片镜检、细菌分离、生化特性鉴定、荧光抗体法检查、间接血凝试验、间接ELISA等，还可以采用平板凝集、试管凝集和琼脂扩散试验相结合的方法进行血清型鉴定。由于鸭传染性浆膜炎与大肠埃希菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌、鼻气管鸟杆菌、考诺尼亚菌等细菌引起的疾病在临床症状和病理变化上相似，因此，亟需建立一种方便、快速、准确的方法进行鉴别诊断。基于此，一些分子生物学方法应运而生。

3.1　RFLP分析法

限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析是第一代以DNA指纹图谱为基础用于微生物分型鉴定的方法。其原理是用限制性内切酶将细胞基因组DNA进行切割，然后在琼脂糖凝胶上电泳分离，以显示不同种群基因组DNA的限制性片段长度多态性。RFLP产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定，但往往会因RFLP产生的指纹图谱十分复杂而造成分析上的困难。RichardB等利用17种内切酶对RA基因组DNA进行了指纹分析，其中以HinfⅠ和DdeⅠ内切酶消化的RA染色体DNA经琼脂糖电泳后的指纹图谱清晰可见，可用于试验中89株RA的鉴别，其余15种内切酶由于酶切图谱杂乱无章而无法应用。

3.2　REP-PCR分析法

重复序列PCR基因指纹分析(Repetitive element PCR genomic fingerprinting，REP-PCR)也是一种以DNA为基础的分型方法，应用于PCR的重复序列主要是BOX片段，大小为154bp，是由保守性不同的亚序列组成。HuangB等利用REP-PCR法分析了35株RA的电泳图谱，得到19个不同的电泳谱型，并认为可根据电泳谱型不同区分同一血清型的不同菌株。该方法对所有RA菌株的适用情况有待于进一步验证。

3.3　16 S rRNA基因序列分析法

16 SrRNA为原核生物核糖体中的一种核糖体RNA，是核糖体小亚基的骨架。其基因在结构上分为保守区、半保守区和非保守区，保守区序列基本恒定，半保守区和非保守区序列因不同种、属细菌而异。16S rRNA所含信息量丰富且长度适中(1 500 bp左右)，易于测序。随着微生物核糖体数据库的日益完善， 16 SrRNA分类系统已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。已有许多株RA的16 SrRNA的部分基因序列被测出，并存入到GenBank中，这为直接利用这些序列设计PCR引物或寡核苷酸探针检测RA提供了便利条件。利用16S rRNA基因片段设计引物对RA进行PCR检测在临床上已得到广泛应用。

3.4　外膜蛋白分析法

胡清海等根据已发表的RA15型CVL110/89株编码42ku主要外膜蛋白的基因序列设计引物，建立PCR方法对7个血清型的RA纯培养菌及野外病死鸭病料进行检测。结果表明，7个血清型的RA纯培养菌DNA均可扩增出809bp的DNA片段，而对照的大肠埃希菌和沙门菌纯培养菌DNA扩增结果为阴性。由此可见，针对外膜蛋白建立的PCR方法也可用于RA的鉴定和快速诊断。

4　防控

4.1　药物

鸭传染性浆膜炎作为一种细菌性传染病，抗生素类药物对其有一定的治疗效果。虽然药敏试验表明RA对多种药物敏感，但实际生产中的应用效果并不理想，要达到比较好的防治效果，必须反复投药，这既增加了生产成本，又易使细菌产生耐药性，且长期使用抗生素类药物势必会破坏正常菌群，影响免疫力，使鸭更易发生感染。因此，制备有效的疫苗来预防鸭传染性浆膜炎是当务之急。

4.2　疫苗

国内外研制的RA疫苗有灭活疫苗、弱毒疫苗，亚单位疫苗正在研制中。Sandhu TS等针对美国主要流行株中的1、2、5型RA研制了三价福尔马林灭活苗，该三价苗对这三个型的细菌均有保护作用，但保护力持续时间较短。PathanasophonP等证明无细胞滤液制备的灭活苗具有与细胞灭活苗同等的效力。

张鹤晓等对不同疫苗免疫鸭的抗体消长规律测定发现，油佐剂疫苗免疫效果最好，甲醛灭活苗两次免疫次之，甲醛灭活苗一次免疫效果最差，同时，他们还从抗体水平角度推断，雏鸭10日龄左右用苗最好。黄瑜等研究了1型RA铝胶苗、蜂胶苗和油乳剂苗3种灭活苗的特性，证实油乳剂灭活苗能提供最高的免疫保护率。此外，吕敏娜等还进行了鸭疫里氏杆菌-大肠埃希菌二联灭活疫苗的研制，经野外试用效果良好。

4.3　外膜蛋白免疫原

近年来，关于细菌外膜蛋白(outer membrane protein，Omp)的研究，国内外学者做了大量工作，也取得了很大进展。Omp在细菌代谢物质的运输、维持细菌的形态及调节细菌有关物质合成方面起重要作用，同时在细菌致病性和免疫原性方面也发挥着重要的作用。

Pathanasophon P等应用饱和硫酸铵沉淀法和SepHadexG-200凝胶柱提纯了1型RA的外膜蛋白，对14日龄雏鸭一次性皮下注射氢氧化铝吸附的RA蛋白(100 μg/只)，免疫后21d攻以同源菌(5×109cfu/只)，可获得100%的保护。苏敬良等用1型RA外膜蛋白抗原加弗氏佐剂免疫北京鸭检测其保护性。结果表明，对同源细菌攻击的保护率为100%。另有试验表明，RA蛋白半数有效剂量为43μg/只，经甲醛灭活的RA菌体疫苗也能很好地抵抗同源菌的攻击，经100 ℃处理1h或用胰蛋白酶处理后完全丧失免疫原性，经脂酶处理后丧失部分免疫原性，表明外膜蛋白是RA的主要免疫原，这为研制和开发RA蛋白苗奠定了基础。

刘燕等分析了4种血清型RA外膜蛋白的电泳图谱，结果表明相同血清型的电泳图谱相似，不同血清型的电泳图谱差异较大。是否可据此将RA按电泳图谱划分为不同的Omp型，需要进一步收集更大量的菌株进行比较，结合流行病学调查资料，进行统计分析才能做出定论。

用细菌Omp制备疫苗，可保护机体抵抗同型或异型菌的攻击，但由于从菌体中直接提取Omp产量太低，所以需要采用一种新的能获取大量Omp的方法。随着分子生物学的发展，克隆表达技术被广泛应用到各种细菌Omp片段的表达中。已有许多基因被克隆并在不同的宿主系统中表达。

5　结语

虽然对鸭疫里默氏菌进行了广泛的研究，但仍有许多问题亟待解决，如目前使用的菌苗都存在一定的弊端，因此研制更加安全、有效、省时省力、能重复使用的新一代菌苗势在必行；传统的诊断方法费时费力，因此探索简便快速特异的诊断方法也是减少经济损失的有效途径；致病机制、免疫原性等尚需深入研究。