摘 要：RNA干扰(RNAi)由双链RNA引起，广泛存在于动、植物中的序列特异性转录后基因沉默，是生物体在进化过程中，抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起的基因组不稳定性的保护机制。论文从RNAi现象、RNAi发生机制、哺乳动物中的RNAi现象和RNAi与抗病毒感染等几个方面做了综述，详细介绍RNAi在哺乳动物中的应用。
关键词：RNA干扰；哺乳动物；应用
分子生物学研究的早期，人们对基因的了解都是通过基因突变而获得的。正向遗传学的优点是可以通过突变现象来揭示基因功能。随着大规模基因组测序的成功，人们鉴定出成千上万个基因，但是却不能全部清楚其功能。近来，反向遗传学技术是最有效的研究基因功能的技术，但基因重组技术耗时又费用高。反义技术，如反义核酸技术、核酶技术也被用于反向遗传学，由于其效率低、专一性差、较大的毒性且用药量过大、成本过高等原因，使它们的应用存在一定的限制。利用由双链RNA引起转录后基因沉默机制，又称RNA干扰(RNAi)，成为分析基因功能的又一种方法，得到了广泛的认可。利用小干涉性RNA技术来抑制(或敲低)脊椎动物细胞中任何基因的表达开始了反义遗传学的革命。
1 RNA干扰现象
1990年， JorgensenR等为了加深矮牵牛花(petunias)的紫色，他们导入了一个外源色素合成基因拷贝，但是试验并未达到预期的结果，许多花瓣的颜色并未加深，反而呈现杂色或者全白色，表明色素的合成不是被增强了，而是被关闭了。这是由于转基因和内源的色素合成基因都被抑制了。JorgensenR把这种现象命名为基因的共抑制现象。CogoniC等将合成类胡萝卜素的基因转入粗糙红色链孢霉，结果导致转化细胞中霉菌本身的基因失活，他们将这种现象称为基因的压制(quelling)。GuoS等在利用反义RNA技术特异性地阻断秀丽小杆线虫(C.elegans)par-1基因的表达时，在试验中给线虫注射了正义的RNA(senseRNA)，为了观察到基因表达的增强，但结果却是同样阻断了par-1基因的表达。当时他们对这一现象没有给出合理解释。直到1998年，FireA等才对GuoS等的现象作出了解释，认为以上现象是由于体外转录的RNA中污染了微量双链RNA而引起。并发现经过纯化的双链RNA要比单链RNA能更有效地特异性阻断相应基因的表达，该小组首次将这一现象称为RNA干扰(RNAinterferenence，RNAi)，由此揭开了研究双链RNA介导特异性基因沉默机制的序幕。
在随后短短的几年中陆续发现RNAi现象也存在于真菌、脉胞菌、拟南芥、锥虫、涡虫、水螅、斑马鱼等大多数真核生物和小鼠的早期胚胎以及体外培养的细胞系中。这种现象提示了RNAi机制是一种进化上保守的防御机制。
2 RNAi的发生机制
RNAi的发生机制最早描述于果蝇的研究中，但RNAi所引起的转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing，PTGS)机制在进化上是高度保守的，哺乳动物中RNAi的过程与果蝇中基本相同。指导mRNA降解的效应分子是一些小的长度为21nt～25 nt的双链RNA(double-RNA)，称为小的干涉性RNA。这些短的RNA是由保守的RnaseⅢ家族成员Dicer切割长的dsRNA所得。长的dsRNA可以是外源的(如病毒RNA复制中间体或人工合成的dsRNA)，也可以是内源的(如细胞中单链RNA在RNA依赖的RNA聚合酶RdRP作用下形成的dsRNA)。siRNA是由21nt～23 nt组成的dsRNA复合物，其长短具有种族特异性，5′端磷酸化，而3′端具有对称的2 nt～3nt的突出。siRNA再与内切核酸和其他的蛋白质一起形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，在ATP的作用下，RISC被激活与靶mRNA相结合形成siRNA-mRNA杂合体，在siRNA中反义链的指导下，RISC内的核酸内切酶在杂合体的中部切割mRNA，切割位点在siRNA5′端10开始。切割产生的21 nt～23nt的dsRNA又可被Dicer切割成siRNA，再进行以上步骤，采用扩增的方式，继续切割mRNA，从而使目的基因沉默。
在真核生物中存在两类不编码的21 nt～22nt小RNA在基因表达调节上起重要作用，如siRNA和miRNA(microRNA)。但两者的作用机制不完全相同。miRNA是保守的内源性茎环结构转录产物，不完全配对。单链miRNA与靶mRNA配对结合，靶mRNA的3′非翻译区(UTR)能与miRNA互补，从而抑制mRNA的转录，却不改变其稳定性。而siRNA则降解靶mRNA，导致PTGS。
3 哺乳动物中的RNAi
3.1 非特异性反应
3.1.1 干扰素反应 虽然RNAi在许多生物中自然存在，如植物、原生动物、昆虫、线虫等，但哺乳动物中至今未发现有RNAi自然存在的证据。把长度超过30ntdsRNA转染进大多数哺乳动物细胞中会导致干扰素反应，一种细胞内的非特异性抗病毒反应，它可以引起非特异性转录抑制以及可能的细胞调亡。研究表明，在小鼠胚胎干细胞和某些胚胎来源的细胞株中没有dsRNA引起的非特异性反应，然而在大多数哺乳动物细胞中，由于非特异性反应存在而无法用长链dsRNA诱导RNAi。为了避免长dsRNA诱导干扰素反应，一般采用短的21nt小的干扰性RNA(siRNA)。siRNA可以化学合成，体外通过T7聚合酶转录或体内裂解合成的dsRNA所得，然后用标准的方法转染细胞培养物。然而，化学合成siRNA相对昂贵，而体外转录又耗时，且产物需纯化，而且两者都只产生暂时沉默。为了征服这些限制，许多实验室构建了表达短的茎环样RNA(shRNA)，它能折叠形成19对～29对碱基的且有一小的loop区样结构，这种结构在体内可被Dicer切割成成熟的siRNA。而且shRNA必须转录成有准确长度的极短的RNA，这一点可以通过用po1Ⅲ启动子和终止信号而完成。由于siRNA和shRNA不长，想象中不可能引起干扰素反应，但是有报道，用siRNA或shRNA载体转染细胞，实际上可诱导中等程度的干扰素反应。干扰素反应具有siRNA或shRNA剂量依赖性，可能是由于siRNA或shRNA饱和时polⅢ转录产物的异常产生堆积而引起。
3.1.2 脱靶现象 与mRNA不匹配的沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，RISC)介导的裂解mRNA的效率与完全互补的RISC的裂解效率相比可显著降低，但基因芯片分析表明，与siRNA序列少于11个连续碱基匹配的非靶转录物表明可以被下调。表明非优化的RISC-mRNA相互作用都可导致RNAi的脱靶现象，这样就使我们对研究RNAi的功能效果受到限制。由于已知的资料有限，所以要用生物信息学分析方法使反义siRNA序列与靶mRNA间不存在连续17nt～18 nt匹配，特别应避免siRNA5′端(2 nt～12 nt)与mRNA间连续匹配。
目前还不清楚脱靶程度有多大，因为芯片技术只能在RNA水平上检测到对蛋白翻译的抑制，在miRNA中有2 nt～8nt区域是miRNA-mRNA间识别区关键部位。因此，为了完全有效地实现沉默需设计多个siRNA，以此来减少脱靶机会。然而，对利用RNAi来进行转基因动物研究表明，从整体上以及细胞培养中脱靶现象很少，而且降低RNAi效应分子的浓度可以减少脱靶效应的可能性。
3.2 siRNA导入方式
3.2.1 DNA载体介导的RNAi 与真菌、植物、蠕虫不同的是，在哺乳动物中siRNA不能复制。因此，果蝇和哺乳动物中通过转染介导的RNAi受到限制。为了克服将化学合成siRNA转染入细胞中的一些缺点，有研究提出DNA载体介导机制，即用DNA载体表达在体内可以转化成siRNA的基质物。
3.2.1.1 用RNApolⅡ启动子介导的表达体系 在不产生或存在弱的干扰素反应的有机体或细胞类型中，可以采用能够表达茎环结构的载体。这种载体用RNA聚合酶Ⅱ作启动子来启动长的茎环结构的表达，后被Dicer裂解为siRNA。这种表达体系可以有效地沉默靶基因的表达。如小鼠卵母细胞和植入前胚胎、线虫和果蝇中。PolⅡ启动子体系是可诱导的。例如，用一个Cal4诱导型体系表达了针对果蝇中β-半乳糖苷酶的茎环样RNA。他们将Cal4反式激活蛋白置于热应激蛋白70启动子的控制下，在果蝇生长期可以通过简单地改变温度来控制茎环结构的表达。尽管这种表达体系可以介导有效的RNAi，但在许多哺乳动物细胞中表达长茎环样RNA可以诱导干扰素反应，故限制其应用。
3.2.1.2 用RNA polⅢ启动子介导的表达体系 许多研究都使用polⅢ作启动子的质粒介导表达体系。它可以产生短的RNA，也不引起明显的干扰素反应。这种表达体系主要有两个polⅢ启动子，即U6启动子与H1启动子，它们都是pol Ⅲ启动子家族中的Ⅲ型成员。
大多数RNApolⅢ启动子含有转录起始位点下游序列，这些序列对以Ⅰ类、Ⅱ类启动子启动的转录非常重要。但是Ⅲ类启动子缺少这些成分。事实上，删除小鼠或人U6启动子中转录起始位点下游序列对转录水平并无影响。尽管U6和H1启动子都有同样的顺式作用元件(八聚体基序，Staf-结合位点，启动子近侧序列元件(PSE)和TATA基序)，但是，H1启动子结构更紧密。U6启动子第1位需1个G，而H1启动子的条件要松一些。此外，RNApol Ⅲ启动子识别4个以上T残基的末端终止信号，以便在没有其他因子作用时准确有效地停止转录。
用RNApolⅢ启动子载体来表达siRNA有两种方法。一是用不同的串联启动子来表达siRNA的有义和无义链。二是表达shRNA后被Dicer裂解为siRNA。
3.2.1.3 用串联启动子表达短的RNA 采用串联U6启动子从不同转录单元分别表达有义和无义链，这些链在体内形成19nt的复合物，此复合物在终止信号处有4 nt的重叠。MiyagishiM等将此方法成功应用于绿色荧光蛋白GFP、荧光素酶基因以及内源性β-连环蛋白的表达。Lee N S应用此方法靶向HIVrev基因，可以有效降低rev-GFP融合蛋白的表达，他们还发现将revsiRNA表达载体与HIV-1基因组DNA(NL3)共转染293T细胞可使病变明显下降。
3.2.1.4 表达短的茎环样RNA 大部分表达体系用U6或H1启动子，Kunath T等报道，用tRNA作启动子的表达体系。用此体系产生的shRNA具有强的细胞质定位特性且可被Dicer有效地处理成siRNA。
3.2.1.5 两条单链与茎环样RNA 很难说清用分开的单链和用茎环样RNA表达的RNAi两种技术在抑制基因表达上谁更有效。HutvagnerG等发现将100 nmol/L的茎环结构的前Let7 RNA导入HeLa细胞浆抽提物中，会有5nmol/L的Dicer处理物产生(Let7 mRNA)，其靶向mRNA的效率与100 nmol/L的Let7siRNA相当。说明Dicer产生的RNA比直接以siRNA形式的RNA更有效地参与RISC介导的切割步骤。
3.2.2 病毒载体介导的RNAi 质粒载体可以有效地介导siRNA，但也有局限，有报道用反转录病毒载体将siRNA导入细胞中。有两类反转录载体用来作介导体系：基于莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMuLv)或小鼠干细胞瘤(MSCV)的致癌反转录病毒载体和来源于人免疫缺陷病毒(HIV-1)的慢病毒载体。
3.2.2.1 反转录病毒载体 Paddison PJ等将U6启动子整合于MoMuLv病毒载体pBabe-puro的长末端重复序列中，由于具有反转录活性，可将LTR复制，因此整合后的构件中含有两份LTR和两份U6表达盒，表达的抗肿瘤抑制因子P53的shRNA可以稳定沉默P53的表达，而且开启肿瘤细胞衰老旁路，引起肿瘤细胞形态改变，从而表现出明显的生长抑制。用反转录病毒载体介导的针对P53不同位点的靶shRNA在感染的造血干细胞中表现出不同的沉默水平。这些造血干细胞来源于Eu-myc小鼠。这些小鼠能在淋巴结中异常表达myc癌基因。当用这些不同细胞系重建致癌性辐射照射的小鼠的免疫系统时，小鼠会形成由myc诱导的淋巴组织瘤。其严重程度直接与P53沉默程度相关。
Brummelkamp TR等将一个H1表达盒整合于灭活的MSCV载体，成功作用于ras-V12基因的一种组成型活性形式(它与野生型ras只有一个核苷酸不同)。用此载体感染人膀胱癌EJ细胞，可以不改变Ras水平却能极大降低Ras-V12的表达。同样，用此载体感染人的胰腺癌CAPAN-1细胞则不形成癌，其表现是不能在软琼脂上形成克隆，在无胸腺的小鼠体内不产生肿瘤。
3.2.2.2 慢病毒载体 慢病毒载体属于反转录病毒载体，但是与致癌反转录病毒载体相比有两个不同特性。一是基于HIV-1的慢病毒载体既能感染分裂期细胞，又能感染非分裂细胞以及分裂期后的细胞。此外，致癌反转录病毒载体执行的是前病毒沉默，导致基因表达下降或停止。而慢病毒载体可抗此沉默，因此可以用于产生转基因动物。
慢病毒载体介导的茎环样RNA可用于感染来自体内的初级树突状细胞。树突状细胞在免疫应答调节中具有重要作用，但难以被研究，因为它们对转染不应答。靶向内源性表达的GFP或细胞凋亡前体因子的慢病毒载体都可使这些基因表达显著降低。初级T细胞用靶向CD25的慢病毒载体感染显示其后的基因表达沉默功能。IL-2是T细胞增殖所必须的，但慢病毒感染的细胞表现出在有IL-2存在情况下细胞增殖力下降75%～80%。
用表达针对于HIV-1共抑制因子CCR5的shRNA的慢病毒载体感染人的外周血T淋巴细胞，结果CCR5的表达降低10倍。当用一个亲CCR5的HIV-1病毒攻击时，HIV-1感染细胞中CCR5表达降低3倍～7倍。尽管慢病毒载体有希望成为基因治疗武器，但是用此反转录病毒为基础的治疗与X-射线有关的免疫缺陷时有两个病人发生白血病的事实暗示在反转录病毒作载体用于基因治疗前必须要找到更好的控制方法。
3.2.3 基于转基因的RNAi 由于载体介导siRNA方法的出现，有可能产生稳定沉默基因表达的转基因动物，这可以通过标准的转基因技术或用慢病毒载体转染胚胎干细胞或囊胞来实现。
将表达靶向DNAN-糖基化酶、Neil-1的shRNA转导小鼠胚胎干细胞，产生了几个具有不同沉默水平的稳定整合的胚胎干细胞系。由此细胞系获得的小鼠携带有可经种系传递的shRNA的表达盒。F1代shRNA阳性小鼠表现出与祖代几乎相同的Neil-1下降水平，从而说明表型沉默从胚胎干细胞传递到子代小鼠间的稳定性。
HasuwaH等将一个靶向小鼠与大鼠内源性GFP的polⅢ表达载体注入鼠单细胞胚胎原核，以此产生沉默的囊胚，用所产的小鼠进行杂交产生F1代。结果在检查的所有组织中都表现出几乎完全沉默。在鼠上基于转基因的RNAi的成功意味着对那些由于缺乏胚胎干细胞系的同源重组的靶基因可用此方法弥补。
LoisC等构建了表达内源性GFP的转基因鼠，用含有GFP基因的慢病毒载体感染鼠的胚胎干细胞系或鼠单细胞胚胎。为了证明慢病毒载体可用于基于转基因的RNAi，GFP阳性鼠的受精卵用表达GFPsiRNA的慢病毒载体感染，所得的囊胚与小鼠都有明显的绿色荧光表达的降低。同样，用表达CD8siRNA的慢病毒载体感染胚胎干细胞后显微注射RAG缺乏的小鼠囊胚，由于RAG缺陷鼠不能产生B或T细胞，那么嵌合鼠的免疫系统来自感染的胚胎干细胞。在转基因鼠的胸腺和脾脏中，CD8＋T细胞数量显著下降。用此载体感染单胚所得的小鼠则CD8＋T细胞缺陷。
这些转基因试验表明，siRNA介导的基因沉默是可遗传的、稳定的，具有应用于各种有机体的可能性。此外，也表明RNA干涉功能可以发生于所有被测的细胞和组织型，从早期胚胎、囊胚到成年动物。目前正在研究可诱导的以及细胞或组织特异性表达的方法，这将使这些技术更加多样，更加有实用价值。
4 RNAi与抗病毒感染
RNAi以及相关现象，如PTGS，可以使植物抵抗病毒的感染。这种机制在其他有机体中也可能存在，还没有证据表明脊椎动物的病毒感染中存在内源性RNAi的活性。不过已经有一些研究表明，用合成的siRNA来抑制哺乳动物病毒的感染很有希望。
Bitko V等报道，用引起严重的呼吸道疾病的负链RSV表达siRNA沉默mRNA的方法。针对RSV特异性的mRNA的siRNA可以降低其表达，不能敲低整个全长的病毒基因组链的表达。推测病毒的基因组由于被包在一个病毒-RNA的复合物中不可能与siRNA全部接触。在另一些研究中，靶向HIV长末端序列和其5个基因的siRNA可以介导HIV在培养的细胞系和人的原代T细胞中的表达沉默。这些研究中的siRNA可以使病毒的复制下降30倍～50倍，而且即使siRNA中有一个碱基与靶mRNA不匹配，这种沉默也可以发生，但是如果有4个碱基不匹配则不会产生相应基因沉默现象。siRNA也可以抗脊髓灰质炎病毒的感染。在试验中评价了siRNA抗病毒的效果。这些研究表明，应该联系应用几个siRNA来防止病毒复制中的选择压力，使病毒对siRNA介导的基因沉默不产生免疫反应。预示将来siRNA可以作为抗病毒治疗的一种。
研究表明，在小鼠体内导入siRNA是有可能的。将siRNA在水压作用下注入鼠尾静脉，可以在转基因鼠的不同组织中检测到基因沉默现象。并不是所有的组织中都有siRNA的表达，但是在肝脏、脾脏、肺脏、胰脏和肾脏中可以检测到相应基因表达下调5倍～10倍。在肝炎C病毒转基因鼠中共转染siRNA可以有效的沉默病毒的表达。由于这些研究中用的转染方法对人存在有害的生理副作用，所以不可能轻易用于人。因此，在人类病毒病的治疗中寻找合适的siRNA导入方式是一个主要的屏障。然而，siRNA可以在体内沉默转基因和致病基因的表达的事实预示有可能用于人类疾病的治疗。
5 结语
许多试验表明，人类的任何一种遗传病都可能作为用RNAi进行治疗的靶。用编码siRNA或mRNA的基因载体作为基因敲除的工具会被接受。这些新的RNAi工具会与慢病毒、腺病毒和其他介导载体一样被用于基因治疗。
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