摘 要：以猪瘟病毒全长基因组质粒为模板，PCR扩增出E2囊膜糖蛋白上A/D抗原区B细胞表位878 aa～938aa；PCR扩增片段连接到pET-32a(＋)载体构建pET-AD原核表达质粒，将阳性质粒转化到BL21大肠埃希菌中诱导表达，以Ni-NTA亲和柱纯化，纯化后的蛋白进行Westernblot鉴定。结果表明，重组质粒pET-AD在BL21大肠埃希菌中可以高效表达，表达的蛋白质经纯化后仍然有反应原性。
关键词：猪瘟病毒；抗原表位；表达；免疫印迹
猪瘟是由猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、致死性疾病，具有高度接触传染性，流行广泛，发病率和死亡率高、危害大等。猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒属。E2囊膜糖蛋白从第690位氨基酸开始，到1061位结束，共包含371个氨基酸残基，是主要的抗原表位集中区。E2蛋白上有15个半胱氨酸，其中N端的6个半胱氨酸能够形成3对二硫键，把整个E2蛋白划分为相对独立的A、B、C、D四个亚区。已经证明，A/D区中690 aa～766 aa区域是一段高抗原性的表位集中区，但并没有阐明其中的核心区域。
本试验构建了A/D区878 aa～938 aa原核表达质粒，转化到BL21大肠埃希菌原核表达系统中进行诱导表达。纯化目的蛋白并经过Westernblot检测，证明此目的蛋白具有良好的反应活性，为进一步研究A/D区核心抗原表位奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒及宿主菌 空载体质粒pET-32a(＋)(及其宿主菌BL21(DE3))和猪瘟病毒全基因组质粒pETC由南京农业大学农业部动物疫病诊断与预防重点实验室提供。
1.1.2 试剂 TaqDNA聚合酶、各种限制性核酸内切酶、胶回收试剂盒和T-easy载体试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；酶标SPA购自武汉博士德公司；DAB试剂盒购自北京中杉公司。
1.1.3 猪瘟阳性血清 猪瘟病毒高免血清由湖南农业大学余兴龙教授提供。
1.1.4引物 A/D P1：GCCGAATTCATGGATACTTGGCGTCATTGC；A/DP2：CCCAAGCTTGCAAGGTCGTATTGTACTTT。扩增猪瘟病毒E2蛋白基因A/D区878 aa～938 aa序列。
1.2 方法
1.2.1 编码A/D抗原区特定基因的扩增、回收和酶切 以pETC质粒为模板，进行PCR。其反应体系如下：ddH2O 35.5 μL,10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L Mg 3 μL ,2.5 mmol/L dNTP 4μL，上、下游引物分别为0.5 μL，pETC 1 μL，最后加入TaqDNA聚合酶0.5 μL，开始PCR。反应程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s,56 ℃ 25 s,72 ℃ 30s,30个循环；72℃ 10 min,4 ℃保存。反应产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳，切下190bp处条带，用小量胶回收试剂盒回收，EcoRⅠ和HindⅢ双酶切37℃ 2 h，同上法回收，置－20 ℃冻存备用。
1.2.2 构建重组质粒pET-AD 扩增含pET-32a的宿主菌，小量碱法提取质粒。用EcoRⅠ和HindⅢ37 ℃ 2 h酶切pET-32a质粒。回收线性化载体并和1.2.1中经双酶切的PCR产物按照大、小片段摩尔比1∶5的比例4℃连接过夜，转化BL21感受态细胞，涂布氨苄平板上，37 ℃培养20 h；挑取单菌落，扩大培养并同上法提取质粒；用SacⅠ酶切鉴定，将阳性质粒命名为pET-AD；含pET-AD菌的重组菌命名为BL-AD。
1.2.3 蛋白质的诱导表达 挑取含重组质粒的单个菌落，过夜培养；翌日按照1%的比例接种100 mLLB培养基，待培养物OD值达到0.5至0.6时，以终浓度1 mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养6 h。
1.2.4 重组蛋白的纯化 将诱导培养产物经超声波破碎后，离心收集沉淀，pH 7.4的Tris-HCl洗涤，用含6mol/L的盐酸胍的pH 7.4 Tris-HCl溶解，室温作用1h，离心取沉淀。按照Novagen公司的产品说明书准备His-Bind镍亲和柱。将溶解后的包涵体加入His-Bind柱，待其自由过柱：当样品液面快到琼脂表面时，加入10倍琼脂体积Bindingbuffer，同法依次加入6倍体积的Wash buffer和6倍体积的Elute buffer，收集Elutebuffer。在Binding buffer、Wash buffer和Elute buffer中都含有终浓度6mol/L的盐酸胍。将收集产物置于2 mL的Elute buffer(不含盐酸胍)中，搅拌共透析24 h，每隔8 h换液1次。
1.2.5 纯化蛋白质的定量 将纯化的蛋白质加入到20 g/L SDS Tris-HCl中，100 ℃煮沸变性5min，用不加蛋白质、20 g/L SDS、同法操作的Tris-HCl调零，于Gene QuantPro RNA/DNACalculatorh上测定最大吸收峰；同法将BSA (牛血清蛋白)按照不同浓度溶于20 g/L SDS Tris-HCl中，测定OD280，并制作标准曲线。将重组蛋白质按照1∶2、1∶4的比例同样操作，每个比例做3个重复，测定OD280，于标准曲线直接读出蛋白质含量并取其平均值。
1.2.6 重组蛋白的Werstern blot 按常规方法操作。
2 结果
2.1 PCR扩增目的基因
取10 μL PCR产物在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳，可见在189bp处出现一特异性条带(图1)。对扩增PCR产物测序，证明所扩增产物是E2基因A/D区序列(测序结果略)。
2.2 表达载体的构建
取20 μL酶切产物在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，可见阳性质粒无法被切开，阴性对照被完全线性化。证明A/D区片段已成功插入pET-32a。
2.3 诱导表达蛋白质的SDS-PAGE
目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，在22 ku处有特异性蛋白质条带。而对照的空载体仅在20 ku处有硫氧还蛋白条带(图2)。
1.A/D表位基因；2.DNA标准DL 2 000；3.阴性对照
1.A/D epitope gene；2.DNA Marker DL 2 000；3.Negative control
图1 A/D区抗原表位的PCR扩增
Fig.1 PCR Amplify of A/D epitope gene
1.空载体对照；2.BL-AD表达产物；3.蛋白质量标准
1.Negative control；2.Product of BL-AD；3.Protein Marker
图2 A/D区抗原表位的诱导表达
Fig.2 Expression of A/D epitope protein
2.4 Western blot分析
BL-AD菌经诱导及Western blot后，在目的条带处有一特异性反应条带(图3)。
1.空白对照；2.目的蛋白Western blot结果；3.蛋白质量标准
1.Negative control；2.Western blot result of BL-AD；3. Protein Marker
图3 A/D区抗原表位蛋白Western blot
Fig.3 Western-blot result of A/D epitope protein
3 讨论
利用生物信息学方法分析猪瘟病毒E2蛋白A/D区抗原表位，得到1段B细胞表位序列。本试验以E2基因阳性质粒为模板，PCR扩增出这段B细胞表位基因。将其插入pET-32a原核表达载体，构建出表达质粒pET-AD。诱导表达的蛋白质既以包涵体又以可溶形式存在，主要以可溶形式存在于超声波裂解上清液中，这非常有利于蛋白质的生产应用。
BL-AD表达的蛋白质经Westernblot鉴定，具有较好的反应原性。说明经生物信息学方法分析的B细胞表位符合实际情况，能与猪瘟抗体阳性血清结合。也证明猪瘟病毒E2糖蛋白A/D区是其线性B细胞表位区。因此，在大肠埃希菌中可溶性表达线性B细胞表位对猪瘟抗体水平的诊断和B细胞表位的研究具有一定的价值。
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