呼和浩特地区奶牛流产胎儿中布鲁菌的分离鉴定

摘　要：布鲁菌病(Brucellosis)是由布鲁菌(Brucella)引起的一种世界范围内的人兽共患传染病，给畜牧业发展带来重大的经济损失。控制布鲁菌病的传播，减少其对人类健康和畜牧业发展的危害已经成为当前亟需解决的问题。该文采用细菌学检验手段，对呼和浩特地区出现流产、早产、死胎、胎盘滞留等疑似布鲁菌病现象的奶牛进行病料采集，并对其进行细菌学分离与鉴定，结果获取了5株布鲁菌菌株，表明该地区存在布鲁菌病。该结果为今后呼和浩特市采取有效措施控制布鲁菌病的流行、蔓延提供了科学依据。

关键词：布鲁菌；分离；鉴定；奶牛

布鲁菌病(Brucellosis)是一种在全世界广泛分布的人兽共患慢性细菌传染病，临床症状与病理损伤可表现为发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生危害。近年来，随着奶牛养殖业在全国各地的迅猛发展以及奶牛流通量的增加，奶牛布鲁菌病在悄然上升。布鲁菌分为羊种布鲁菌(B.melitensis)，牛种布鲁菌(B.abortus)，猪种布鲁菌(B.suis)，绵羊种布鲁菌(B.ovis)，犬种布鲁菌(B.Canis)和沙林鼠种布鲁菌(B.neotomae)。布鲁菌在种间大都有宿主交叉感染性，并具有极为明显的宿主危害倾向性，人和羊对羊种布鲁菌高度易感，牛种布鲁菌对人的易感性及危害性相对较轻，但对牛则高度易感，猪种布鲁菌对猪和人均表现出高度易感性，但对牛较不敏感。

羊种布鲁菌、牛种布鲁菌和猪种布鲁菌引起的布鲁菌病流行在我国最广，危害最为严重。家畜布鲁菌病最常发生于羊、牛和猪。本试验应用传统的实验室细菌学技术对呼和浩特市及周边地区的6份疑似病料进行布鲁菌的分离鉴定。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　培养基　胰蛋白月示琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、硝酸盐培养基、Dunham氏蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、石蕊牛乳培养基、明胶培养基、葡萄糖培养基、氧化酶培养基、脲酶培养基、触酶培养基、枸橼酸盐培养基，均参照文献配制。

1.1.2　试剂　布鲁菌阳性血清，布鲁菌病凝集试验阴性血清，甲基α-萘胺，对氨基苯磺酸，20mL/L对位二甲基氨基苯甲醛酒精溶液，浓盐酸，α-萘酚酒精溶液，400 mg/L氢氧化钾溶液，1∶10萋尼氏石炭酸复红储液，5mL/L乙酸溶液，10 mL/L美蓝溶液，沙黄饱和水溶液，氢氧化钾溶液，1 mL/L硫酸，10g/L石炭酸美蓝溶液，草酸胺结晶紫水溶液，革兰氏碘溶液，950 mL/L酒精溶液。

1.2　方法

1.2.1　病料的采集　病料采自呼和浩特市及其周边地区六个牧场(编号分别为1,2,3,4,5,6)的奶牛流产胎儿脏器，采集好的病料分别装入盛有300mL/L灭菌甘油-生理盐水溶液的广口瓶内，4 ℃冷藏保存。标准菌株由内蒙古农业大学动物科学与医学学院传染病实验室保存并提供。

1.2.2　分离培养　将流产胎儿的肝、脾、肺等组织分别接种于胰蛋白月示培养基内，一式两份，分别置大气条件和体积分数为5%～10% CO2环境条件下，37 ℃恒温箱内培养3 d～7d。取出培养皿，观察菌落生长情况，如有菌落生长，对可疑菌落进行涂片染色镜检及血清学检测，再做纯化培养并进行生化鉴定试验。如无菌落生长，则继续培养15d～30 d。

1.2.3　染色镜检

1.2.3.1　革兰氏染色法　参照文献进行。

1.2.3.2　改良萋-尼氏染色法　挑取疑似布鲁菌菌落做成涂片，在已干燥、固定好的涂片上，滴加石炭酸复红液染色10 min，水洗。用5mL/L醋酸处理不超过30 s，充分水洗。用10 g/L美蓝轻度复染20s，水洗。吸干或自然干燥后，镜检。布鲁菌被染成红色，背景为蓝色。

1.2.3.3　科兹洛夫斯基染色法　挑取疑似布鲁菌菌落做成涂片，在已干燥、固定好的涂片上，滴加20g/L沙黄水溶液，加温染色至出现气泡为止(约1.5 min)，充分水洗1 min～2 min,10 g/L孔雀绿水溶液染色0.5min～1 min；水洗。吸干或自然干燥后，镜检。布鲁菌呈红色，球杆状，其他菌类呈绿色(最好在40 min内镜检，经久则红色褪去)。

1.2.4　血清凝集试验　分别挑取疑似布鲁菌菌落，与布鲁菌阳性血清和布鲁菌阴性血清作凝集试验。在1 min～2min内，用肉眼观察是否出现凝集反应，出现凝集颗粒反应呈阳性；不出现凝集颗粒反应呈阴性。同时设生理盐水对照。

1.2.5　分离株的纯化　将初步判定为布鲁菌的菌落划线转接于胰蛋白月示琼脂培养基上，分别置大气条件和体积分数为5%～10% CO2环境条件下，37℃恒温箱培养3 d～5 d。

1.2.6　生化鉴定

1.2.6.1　葡萄糖发酵试验　将培养纯化后的细菌接种于葡萄糖培养基中，置37 ℃恒温箱培养1 d～7 d，观察结果。

1.2.6.2　麦康凯琼脂发酵试验　将培养纯化后的细菌接种于麦康凯琼脂培养基中，置37 ℃恒温箱培养1 d～7 d，观察结果。

1.2.6.3　VP试验　将培养纯化后的细菌接种于葡萄糖蛋白胨水溶液中，置37 ℃恒温箱培养2 d～3d后，先加α-萘酚酒精溶液1.0 mL，再加400 g/L氢氧化钾溶液0.4mL，充分混匀，在数分钟内出现红色者为VP试验阳性，颜色不变为VP试验阴性。

1.2.6.4　吲哚试验　将培养纯化后的细菌接种在Dunham氏蛋白胨水培养基中，置37 ℃恒温箱培养1 d～2d，向培养物中慢慢加入20 mL/L的对位二甲基氨基苯甲醛酒精溶液0.5 mL～1.0mL，不要摇动，使其形成明显两层，即试剂重叠于培养物之上，再加浓盐酸1滴～2滴，注意观察培养物与试剂交接面上的变化，呈红色者为吲哚试验阳性反应，无变化者为吲哚试验阴性反应。

1.2.6.5　脲酶试验　将培养纯化后的细菌接种于脲酶液体培养基内，置37 ℃恒温箱培养1 d～4d，脲酶液体培养基由橙黄色变为桃红色者为阳性反应，不变色者为阴性反应。

1.2.6.6　明胶液化试验　以接种针分别挑取培养纯化后的细菌，穿刺接种于明胶培养基上，在22 ℃下培养，一般2 d～3d，每天观察结果。如室温在20 ℃以上时，培养2 d～3d后，可把培养物放入冰箱，然后取出观察，凡液化明胶者为阳性，不液化明胶者为阴性。

1.2.6.7　柠檬酸盐利用试验　将培养纯化后的细菌接种于枸橼酸盐培养基上，置37℃恒温箱培养4d，每天观察，培养基从绿色转变为蓝色为阳性，阴性者培养基仍为绿色。

1.2.6.8　硝酸盐还原试验　将培养纯化后的细菌接种于硝酸盐培养基上，在37℃恒温箱培养1 d～4d后，加入α-萘胺和对氨基苯磺酸各数滴，出现红色者为阳性反应，颜色不变者为阴性反应。

1.2.6.9　接触酶试验　取1滴30mL/L的过氧化氢于玻片上，然后分别用接种环取1环培养纯化后的细菌，加到玻片上与试剂混合，有大量气泡产生者为阳性反应，不产生气泡者为阴性反应。

1.2.6.10　氧化酶试验　取1滴氧化酶试剂于滤纸上，然后分别用接种环取1环培养纯化后的细菌，加到滤纸上与试剂混合，在5 s～10s内变为紫黑色者为阳性反应，不变色者为阴性反应。

1.2.6.11　石蕊牛乳试验　将培养纯化后的细菌接种于石蕊牛乳培养基中，在37 ℃恒温箱培养1 d～4d后，石蕊牛乳培养基变成蓝色者为阳性反应；不变色者为阴性反应。

2　结果

2.1　分离培养结果

将6份病料分别接种于胰蛋白月示培养基内，置体积分数为5%～10% CO2环境条件和大气环境条件下，37 ℃恒温箱培养3 d～7d后，有5份接种病料的琼脂培养基上长出无色透明，细小、圆形、隆起、略带蓝色荧光的菌落，菌落表面光滑湿润，边缘整齐。以上有细菌生长的5份检样的编号分别是2号、3号、4号、5号和6号。将分离到的可疑菌落用不同染色方法进行染色，光学显微镜下观察细菌形态，并进行血清凝集试验。2号～6号菌株均符合布鲁菌的形态及染色特性，其结果革兰氏染色呈阴性球状小杆菌，多为单个存在；萋-尼氏染色呈鲜红色球杆状；科兹洛夫斯基染色为红色球杆状。血清凝集试验均为阳性。

2.2　生化鉴定结果

将分离出的5株菌进行纯培养后分别接种于各种生化培养基上，经培养观察及试验鉴定，5株菌均符合布鲁菌的生化特性，其结果见表1。

表1　生化鉴定结果

Table 1　Results of biochemistry identification

注：①“＋”代表反应阳性，②“－”代表反应阴性。

Note：①“＋”means positive；②“－”means negative.

通过以上细菌形态、培养特性、生化试验和血清凝集试验，2、3、4、5、6号菌株均为布鲁菌。

3　讨论

布鲁菌生长繁殖需要的营养成分和培养条件比较苛刻。选择适合其生长的培养基是非常关键的，本试验采用的胰蛋白月示琼脂培养基是分离培养布鲁菌的常用培养基，许多实验室在常规培养野外样品以及实验室进一步继代增殖都在培养基内加入血清，鉴于此，本试验在培养时加入了葡萄糖、血清等营养成分；增殖培养时需要严格的无菌操作，如果培养材料被其他细菌污染，则很难分离到布鲁菌，因为污染菌生长速度常常超过布鲁菌，在分离培养时发现，有许多菌落不符合布鲁菌的菌落特征，为了抑制杂菌的生长，常在增菌培养基中加入放线菌酮、杆菌肽、多黏菌素、万古霉素、制霉菌素等抗生素来抑制其生长。

病原分离鉴定是诊断奶牛布病的传统方法，虽然比较繁锁，但该方法可直接查到病原体，检出率高，能对患牛做出确切的诊断，是检测布鲁菌的最好办法。

由于流产奶牛病料的采集比较困难，本试验仅对呼和浩特市地区的6份奶牛流产胎儿的脏器进行了细菌分离培养，其中只有1株(1号)未分离到布鲁菌。其余5株细菌，经不同染色及菌落形态、生化试验、血清学试验等方法系统鉴定后，确定分离出的5株菌均为布鲁菌，表明在内蒙古呼和浩特市及周边地区奶牛中确实存在布鲁菌病。