精原干细胞体外培养研究进展

摘　要：精原干细胞(SSCs)是指位于睾丸生精小管基膜上既能自我更新维持自身群体数量恒定，又能定向分化形成精母细胞，最终形成精子的一类原始干细胞。其体外培养以及近年来兴起的移植、基因转染的深入研究，为探讨精子的发生机制、重建不育个体的精子发生、生产转基因动物提供了新的途径。文章综述了精原干细胞体外培养的研究现状，并对其体外的纯化、鉴定，以及未来的应用进行了介绍，旨在为精原干细胞的研究提供借鉴。

关键词：干细胞生物学；体外培养；精原干细胞

精原干细胞(spermatogonial stemcells，SSCs)是位于睾丸曲细精管基膜上既能自我更新维持自身群体恒定，又能定向分化，最终产生精子的一类原始精原细胞。精原干细胞技术的发展和应用，为深入探讨干细胞状态的维持、自我更新的方式、增殖及分化过程的启动和调控等生物学机制的研究提供有效途径，成为一种极为有用的生物学方法，同时，精原干细胞也是研究减数分裂极好的素材。自从精原干细胞分离及纯化成功并展示其广阔的应用前景以来，各种哺乳类精原干细胞系及其体外长期培养系统的建立已成为越来越多学者关注的热点。

1　体外培养

哺乳动物精原细胞的体外培养早在20世纪60年代就开始了。截至目前，我国科研院所已相继建立了小鼠、人、兔、山羊、绒山羊、五指山猪等精原干细胞的体外培养体系，在国外也已先后建立了牛精原干细胞的长期培养系统、冷冻保存技术体系及移植技术。

1.1　基础培养基

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。一般首选MEM做黏附细胞培养，RPMI-1640做悬浮细胞培养，无血清培养的首选是AIMV培养基(SFM)。对于精原干细胞体外培养基础培养基的选择，有人采用DMEM，也有人采用MEM，还有人报道精原干细胞在CMRL-1066培养基中存活较为理想。IzadyarF等证明在MEM中的细胞活力和增殖能力明显高于KSOM；DiramiG等研究表明将提纯的猪A型精原干细胞在DMEM/F12和KSOM中培养120h后，在KSOM中可见30%～50%的精原干细胞，而在DMEM/F12只有很少的存活。DMEM是精原干细胞培养中最常用的基础培养基，而在DMEM基础上改良的IMDM培养基更适宜于精原干细胞的生长。

1.2　饲养层

目前的研究状况，要使精原干细胞在体外存活并保持干细胞状态，必须与饲养层细胞共培养或添加不同的生长因子。一般采用STO(一种已建系的小鼠胚胎成纤维细胞)、MEF(小鼠胚胎原代成纤维细胞)等作饲养层以抑制其自发分化，保持其干细胞状态。NaganoM等报道，在STO饲养层细胞上，可将小鼠精原干细胞维持培养3个月。徐富翠等用原代培养的小鼠骨髓基质细胞作为饲养层能起到胚胎成纤维细胞相似的功能；何大维等建立昆明小鼠精原干细胞与支持细胞共培养的细胞模型，证明精原干细胞在体外支持细胞层上呈集落样生长，并能长时间维持细胞集落形态及数目；成钢等在五指山猪近交系精原干细胞体外培养研究中显示，SSCs集落接种在STO饲养层后，贴壁良好，但不能在STO饲养层上长期培养；据报道，SCF、LIF、GDNF、bFGF、EGF、IGF-1、PDGF、IL-11、OSM可以促进精原干细胞在体外培养存活和增殖。饲养层细胞除了对SSCs体外培养起支持作用外，还能分泌免疫保护因子，以及多种生长因子和营养因子，提供了与体内的SSCs增殖分化一致的微环境。

1.3　培养温度

尹明等研究表明，分离纯化的小鼠精原干细胞在34 ℃下细胞平均存活时间、增殖数量明显高于37 ℃和30℃。李莲军等认为32 ℃～37 ℃对精原干细胞的生物学行为无明显影响，均可用于培养精原干细胞。

1.4　血清添加量

血清对SSCs体外存活和增殖的作用因培养基和饲养层的不同而不同。张仕强等认为25 mL/LFBS浓度的试验组相对克隆形成率最高，而高血清浓度反而抑制了SSCs克隆的形成，这与Fariborz I等的研究结果一致。

2　精原干细胞分离的鉴定

A型精原细胞的分离、纯化，过去常选用单位重力沉降法、牛血清白蛋白梯度及单位重力速度沉降法等分离纯化法。McLean DJ等根据已分化生殖细胞对高温的敏感性，SinoharaT等采用低光散射特性、α整合素阳性、α整合素阴性多参数筛选策略，用荧光激活细胞分选法都获得了高纯度的精原干细胞。LzadyarF等将小牛睾丸细胞在Nomarski光镜下对DBA染色和c-kit均为阳性的细胞进行分离，再通过Percoll不连续密度梯度法分离，最后得到65%～87%的高纯化A型精原细胞。vonSchonfeldtV等应用于磁性细胞分类技术亦能快速、有效地分离仓鼠、小鼠及猴的精原细胞。何大维等应用Sertoli细胞与生殖细胞差异贴壁特性，以及6d小鼠睾丸生殖细胞几乎为SSCs特性，获得了高纯度的Sertoli细胞及SSCs；Percoll密度梯度离心法是最常用的分离方法，利用Percoll法纯化睾丸细胞，精原干细胞纯度可达60%，支持细胞纯度可达80%，并且可以分离出支持细胞做饲养层。

SSCs的鉴定主要包括形态学鉴定、细胞表面特异性标志鉴定和功能鉴定。精原干细胞形态学鉴定常规方法是用光镜、电镜手段，根据细胞的形态结构加以鉴定。Dym等用免疫组化法，通过显示精原干细胞上c-kit受体的存在，即可鉴定精原干细胞；Shinohara等发现小鼠精原干细胞表达β-1和α-6整合素表面标志，并用其抗体鉴定了小鼠精原干细胞；李莲军等利用AP活性结合细胞形态检测精原细胞。

3　精原干细胞的应用前景

精原干细胞体外培养技术与冷冻技术相结合，建立精原干细胞库，可为珍稀动物和优良家畜的保种提供又一新途径。

利用精原干细胞技术制作转基因动物的方法，克服了传统技术手段成功率低(大动物，如猪、牛、羊等)、设备昂贵、生产成本高等弊端，并且精原干细胞途径直接转染的是位于曲细精管中，生成精子的基底层细胞-精原干细胞。转染后的精原干细胞经一系列的有丝分裂和减数分裂，最终形成携带外源基因的精子。转染成功的精子可在附睾内成熟，经过生理状态的调整，其活力和受精能力均不会受影响。一个精原干细胞经一个精子发生周期即可形成212个精子，且精原干细胞具有恒定自身数量、无限增殖的潜力。

另外，在移植前通过改造细胞中有缺陷的基因，将会为克隆动物、转基因动物的生产、无精男性不育及一些人类遗传疾病的基因治疗提供新的机遇与途径。

精原干细胞技术与动物选种工作相结合，将会大规模的生产出优良家畜，为人类带来丰盛的优质动物产品。

精原干细胞体外培养分化和移植系统的建立，将会为研究精子发生机理提供又一项基本操作平台。

精原干细胞体外培养、分化和移植技术已成为研究精子发生机理的重要模型，进一步了解精子发生的分子和细胞机理，对于发育生物学、生命起源及生育控制具有重要的意义；常规性控精液主要是在精子生成后，借助精子的物理及生物学特性，对X、Y精子加以分离，其方法对精子造成不同程度的打击，且因分离效率低，受胎率差等缺陷而在生产中推广缓慢；而精原干细胞体外培养研究技术，更为直观、便捷，且完全可控，降低了在体试验中不确定因素对X、Y精子发生过程的影响，便于了解精子发生机理，调控精子发生过程，从而可从源头上对X、Y精子进行筛选，是今后家畜性别调控研究的一项重要技术手段。