免疫组织化学技术在兽医诊断中的应用

摘　要：免疫组织化学技术是利用抗原抗体特异性结合的原理，将物质标记在抗体上，通过标记来显示抗原抗体复合物的存在。随着免疫组织化学技术的发展和成熟，已被广泛应用于兽医诊断中，除用于对病原体准确的检测外，主要用于病原在机体组织中的定位和动态分布特点研究、新病原的发现、活体动物中病原的检测、以及对固定组织进行回顾性研究等，是广泛使用的现代病理学研究手段之一。

关键词：免疫组织化学技术；兽医诊断；组织分布；定位

免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)又称免疫细胞化学(immunocytochemistry)，简称免疫组化，是在组织化学的基础上发展起来的，是组织化学的分支，其主要原理是利用抗原与抗体特异性结合的原理，以抗体作为特异性染色的载体，将一些物质标记在抗体分子上，使抗原抗体复合物可以在显微镜下直接观察，从而实现对细胞或组织内的相应抗原进行定性、定位或定量检测。免疫组织化学技术的出现和发展给传统病理学带来了一场革命，使纯形态的病理学发展成为了形态与免疫信号相结合的现代病理学。免疫组化技术应用于病理诊断始于20世纪70年代，应用多年来对病理诊断产生了深刻的影响，其由病理诊断中的辅助技术，已逐渐成为一个强有力的检测工具，显著加强了病理学家诊断疾病的能力。这主要是由于IHC可以在石蜡切片、冰冻组织和细胞制品上检测组织中种类广泛的病原，以及对活体动物中病原的检测，亦可用于对动物体内病原的动态分布、半定量等研究。此外，IHC还可对固定组织进行回顾性研究。免疫细胞化学技术在细胞、亚细胞水平原位检测抗原分子，是其他任何生物技术难以达到和代替的，它能在细胞基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成新的检测系统。虽然聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)方法已经广泛应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制PCR在病理组织学上的应用。

1　对组织中常规或特殊病原的检测

IHC技术之所以在兽医诊断中得到广泛应用，尤其是针对传染病的诊断，有很多方面的原因，其中之一是IHC技术可以快速而准确地检测出多种病原，如细菌、病毒和原虫，并包括那些无法在体外分离培养的病原。

周春宇等建立了检测鹅细小病毒(gooseparvovirus，GPV)的间接酶免疫组织化学方法，该方法可用于GPV感染的组织器官和细胞的抗原定位检测和直观判断。

张玲娟等建立检测禽白血病J亚群(Avian leukosis virus subgroupJ，ALV-J)的组织芯片免疫组化法，结果在发病鸡的肝脏、脾脏、肾脏、卵巢、腺胃、骨髓、髓细胞瘤组织中均检出病毒阳性抗原，从而表明组织芯片技术和免疫组化染色相结合为临床诊断ALV-J提供了一个高通量、敏感的检测方法。

张永强等利用原核表达，单抗制备等技术制备出朊病毒蛋白(prion protein，PrP)特异性单克隆抗体，再用制备出的特异性单克隆抗体作为核心试剂初步建立了中国自主知识产权的羊痒病免疫组化检测方法，为有效抵御羊痒病的入侵提供了强有力的物质和技术保障。

朱琪等建立了特异性强且快速简便的间接免疫荧光抗体法，用于鸭疫里氏杆菌病的诊断与流行病学调查，证明有较强特异性和敏感性，可以用作鸭传染性浆膜炎急性死亡病例的快速诊断。

遇秀玲等采用针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)的特异性单抗，建立了检测PRRS、PRV、PCV的免疫组化技术，可在感染猪多脏器组织中快速、特异地检出病原。

孟琼华等建立了间接免疫组化法检测组织中的鸭疫里氏杆菌，结果表明此方法具有特异性强、无假阳性、经济、简单易行的优点，可用于临床鸭疫里氏杆菌感染病例的诊断。

另外，IHC也可在同一被检样品上进行多种病原体的鉴别检测。Deborah MH等用IHC确定了养牛场中公牛心肌炎的主要病原体。他在检测92头死于心肌炎的公牛感染组织时，每个标本同时使用4种抗体(嗜血杆菌、牛支原体、溶血性曼氏杆菌、牛病毒性腹泻病毒)，结果在70例心肌炎病例的心脏受损部位发现了嗜血杆菌，而牛病毒性腹泻病毒仅出现于4例中，表明嗜血杆菌是公牛心肌炎相关的主要病原体。

Bildfell RJ等人用IHC技术检测到A型流感病毒、犬瘟热病毒、衣原体、分支杆菌及新孢霉素等病原，这些病原很难在体外分离培养且费时。姚斐等采用间接免疫荧光抗体技术，检测组织切片中活的非可培养状态(viablebut nonculturablestate，VBNC)的副溶血性弧菌，此法可迅速准确地检测出VBNC的副溶血性弧菌。IHC技术的应用为实验人员节省了大量的时间和精力，将人们从分离培养病原的繁重工作中解放出来。因此，IHC技术已或将替代许多传统常规诊断方法和体外分离培养技术，或作为补充方法。

2　病原在机体的定位

虽然IHC无法精确测定病原体的含量，但它既可发挥病理学检测的直观性，又能够对抗原进行精确定位，如犬传染性肝炎病毒定位于细胞核内、犬瘟热病毒同时定位于胞质和胞核、狂犬病病毒只定位在细胞质内等。这是PCR等其他检测手段无法做到的。

张平英等以蔗糖密度梯度离心法提纯的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SC1株作为抗原，免疫家兔制备兔抗PRRSVIgG，成功建立了检测PRRSV抗原的间接免疫酶组织化学法。用该方法检测PRRS SC-1株人工感染28日龄仔猪，在感染后7d即可在肺门淋巴结、胸腺、扁桃体、十二指肠、肺、大脑和肾脏检测到PRRSV抗原。PRRSV抗原主要分布于胸腺和十二指肠感染细胞的胞浆内、肺门淋巴结小梁周围的淋巴窦和弥散的淋巴组织、扁桃体淋巴结的隐窝及其周边。

陈海军等建立了检测石蜡组织切片中Ⅰ型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virustype，DHV-Ⅰ)的间接免疫酶染色(indirect immunoperoxidasestaining，IIS)方法，并用其对DHV-Ⅰ强毒人工感染死亡或濒死雏鸭的各个组织器官进行了检测。结果发现，DHV-Ⅰ死亡或濒死雏鸭的肝、脾、肾、心、胸腺、腔上囊、胰腺、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直肠的免疫组织化学检测呈阳性或强阳性，DHV-Ⅰ抗原主要分布于感染细胞的细胞质。

徐超等用间接酶免疫组化检测感染鸭体内的鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)，结果发现DPV主要分布于肝、肺、肾、脑、十二指肠、空肠、回肠、直肠、法氏囊、脾脏、腺胃以及食管中的上皮细胞和巨噬细胞。

刘维平等应用鸭源血清Ⅰ型鸭疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)作为抗原，免疫兔制备兔抗RA的IgG，建立了检测雏鸭感染鸭疫里默氏杆菌的间接免疫酶组织化学法。用该法检测RA人工感染发病死亡雏鸭，可在心脏、肝脏、肺脏、肾脏、十二指肠、盲肠、直肠、脾脏、法氏囊、胸腺、胰脏、脑和腺胃检测到RA抗原，RA抗原分布于细胞浆、组织间隙和血液；检测RA人工感染病例与RA肝脏分离符合率为100%，检测临床可疑病例的血清Ⅰ型RA的阳性率比细菌分离率高。

3　病原在机体的动态分布研究

病原体在机体内的动态分布研究是动物传染病学研究的重要组成部分，它为疾病的发病机理研究、诊断和流行病学调查提供了理论依据，对疾病的预防和控制具有重要的意义。目前，对病原体在机体内的分布研究主要采用分子生物学技术、酶联免疫吸咐试验、免疫酶组化法、琼脂糖凝胶沉淀试验和细菌计数等方法。

通过IHC方法可明确观察到致病病原在组织培养细胞和机体细胞内的生长增殖动态，即病毒从宿主一个细胞到另一个细胞，从一个部位到另一个部位的扩散过程。IHC方法还可在脏器组织原位检测出病原的同时观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疫病的发病机理和病理过程。同时，它还可以准确检出肉眼病变不明显的组织内的病原。

唐宁等将PCV-2BF株经滴鼻接种28日龄健康普通仔猪，于接种后不同时间剖杀，采集相关的器官组织制备组织切片，使用免疫组化方法检测病毒在猪体内的分布。结果显示，淋巴结、脾脏、扁桃体等淋巴组织均出现阳性信号，心、肝、肺、肾、胃、十二指肠、大脑及小脑同样存在阳性细胞，其他组织呈阴性反应。阳性信号主要位于感染细胞的胞质中，偶尔出现在细胞核内。

杨玉莹等用J亚群禽白血病病毒单克隆抗体通过免疫酶组化试验对不同组织进行了抗原定位观察，结果观察到，骨髓瘤细胞内及脾脏内单核巨噬细胞，部分肾小管上皮细胞胞浆具有较强阳性信号，在肝脏、睾丸的实质细胞内呈较弱的阳性反应。这种阳性反应的强弱说明该病毒对不同组织感染程度不同，或许与它对组织的嗜性有关。

张平英等通过建立的PRRSV免疫组化检测方法，观察了感染1 d～35d病毒抗原在仔猪体内靶器官组织中的动态分布特点，发现PRRSV抗原主要分布在脾脏、淋巴结、肺脏、肝脏的巨噬细胞和肾脏的血管内皮细胞，并导致相应的病理组织学变化。

许金俊等采用间接酶抗体染色技术，对人工感染肾型传染性支气管炎病毒C9001株的鸡免疫器官中的病毒进行了检测，结果法氏囊从感染后2d～12 d，胸腺从感染后3 d～8d均检测到病毒抗原。胸腺和法氏囊是病毒侵害的主要免疫器官，脾脏和盲肠扁桃体仅呈一过性感染，哈德氏腺中未检测到病毒。

4　新病原的发现

IHC技术也被广泛用于疾病新病原的发现。Ellis J J等和West KH等用IHC技术发现了猪断奶后多系统衰竭综合征(Porcine post weaning multisystemicwasting syndrome，PMWS)和猪圆环病毒2型(Porcinecirocvirus，PCV-2)之间的联系。他们用IHC在PMWS猪的病变组织中发现了大量的PCV-2，这是表明两者相关的最有力证据。后来，O′ConnorB等用IHC又陆续在其他综合征(如生殖障碍及心肌炎等)中也发现了PCV-2。

5　活体动物中病原的检测

IHC技术对疾病的诊断多用于尸检组织，其实IHC技术也可对活体动物进行一些病原检测。如犬瘟热病毒可感染包括真皮组织在内的许多组织，Haines D M等用IHC方法在急性感染了犬瘟热的活体犬毛皮中检测到犬瘟热病毒。同样，感染牛病毒性腹泻病毒(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)的牛，其体内各个器官组织都存在BVDV， Njaa BL等用IHC法在活体牛身上检测到BVDV，从而取代了检测该病毒的其他方法，目前IHC法被广泛用于牛群中BVDV的筛查。

6　对固定组织进行回顾性研究

IHC自动染色技术的开发大大提高了其结果的可靠性。由于可以同时处理大量切片，使IHC技术在许多回顾性和前瞻性研究中起到了重要作用。由于许多动物养殖场位于较偏远地区，新鲜组织不能及时送到兽医检验部门，因此先将样本收集起来，保存于甲醛中，方便时候再集中送去检验。例如，以前人们很难分辨病牛是死于BVDV感染，还是支原体感染，Haines D M等和Shahriar FM等用IHC技术对收集的大量样品进行检测，从而找出了导致牛死亡的真正致病原。徐超等用建立的间接酶免疫组化对甲醛固定组织进行回顾性诊断检测，他们对1992年－2004年经100mL/L福尔马林保存的鸭瘟临床病例的肝脏用该方法检测，结果均为阳性。

7　结语

IHC技术除了用于医学诊断，还被广泛地应用于许多人医和兽医疾病的研究领域。随着分子生物学和分子遗传学的发展，依靠免疫组织化学方法观察基因表达产物及细胞增殖功能是当前研究的热点课题。许多重要的细胞因子、受体和信号分子都找到了相应的特异性抗体，使得IHC技术在病理学、免疫学及发病机理的研究中将发挥着更大作用。IHC技术的工艺和原理从发现之初至今都有了很大的提高，通过可直观的观察到特异性抗原抗体的结合，解释了许多前人的疑问，相信随着技术的逐步完善，IHC技术定会在兽医诊断中有更大的贡献。