猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及其应用

摘　要：参照国内外已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1的基因序列及其相关的PCR检测方法设计一对引物，扩增目的片段为493bp。通过对PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验，建立了一种PCV-2的PCR检测方法。应用此方法对临床样品进行了检测，阳性检出率达51.18%。该方法具有快速、敏感、特异等优点，可用于PCV-2的检测和流行病学调查等。

关键词：猪圆环病毒2型；ORF1基因；PCR；检测

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV-2)为无囊膜的单股负链DNA病毒，是目前发现的最小的动物病毒。PCV-2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、怀孕母猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪呼吸道疾病、猪皮炎和肾炎综合征、幼龄仔猪A 2型先天性震颤等疾病。PCV-2是20世纪90年代初首先从出现断奶仔猪多系统衰竭综合征的病猪体内分离出的一种病原，如今已成为严重危害养猪业健康发展的主要病原之一，引起了国内外学者的广泛关注。我国自2000年报道首例猪圆环病毒感染以来，该病已普遍发生，表现为流行范围广，阳性率高，混合感染严重，种猪感染率高，在临床上表现为不同的临床综合征。

该病有时呈亚临床感染，所以做好该病的诊断显得尤为重要。鉴于PCV-2对养猪业的巨大危害，国内外都对其检测和流行病学进行了一定的研究，除了传统的病毒分离、免疫荧光法、ELISA、免疫组化法等方法以外，还建立了检测PCV-2的PCR、竞争PCR、套式PCR和实时荧光PCR等诊断方法。与传统方法相比，PCR具有较高的敏感性和特异性，操作简便，是最常见和最普遍的诊断方法。为了解陕西省PCV-2的流行情况和危害程度，我们建立了检测PCV-2的PCR方法，并应用该方法对采自陕西省不同地区的疑似病料进行了检测。

1　材料与方法

1.1　病料和参考毒株

病料采自陕西省汉中市、宝鸡市、杨陵区等地；

标准毒株来源于河南省农科院；猪圆环病毒1型(PCV-1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等参考毒株均由西北农林科技大学畜禽重大疫病防治与畜产品安全实验室提供。

1.2　主要试剂

病毒基因组DNA提取试剂盒购自百泰克公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA标准DL2 000，均购自大连TaKaRa公司；其余均为国产或进口分析纯试剂。

1.3　病料的处理

取猪脾脏组织1.0 g～2.0 g，剪碎，加少量灭菌PBS(含青、链霉素100U/mL，pH7.2)用无菌研磨器研磨至糊状，再用PBS按1∶4的体积比稀释成乳剂，－20 ℃反复冻融3次，在4 ℃以6 000r/min离心10 min，取上清，置－70 ℃保存备用。

1.4　引物的设计

参照GenBankPCV-2(参考登录号、EU266599、EU266596、EU136715)的全基因序列中的ORF1序列，利用Oligo6.0、Primier5.0等生物软件设计了一对特异性引物P1/P2。P1：5′gagtct ggt gac cgt tgc′3；P2：5′ttc ctc cgt gga ttgttc′3，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5　总DNA的提取

病毒DNA的提取方法参照病毒基因组DNA提取试剂盒的说明书进行。

1.6　PCR扩增

以病毒基因组DNA为模板，用P1/ P2扩增目的基因片段，反应体系为10×Buffer(含MgCl2)5.0 μL，dNTPs(10 mmol/L)4.0 μL，P1/P2(25 pmol/L)各1.0 μL；rTaqDNAploymerase 0.5 μL，DNA模板1.0μL，ddH2O38 μL。混匀后置PCR扩增仪中，扩增条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃50 s,52 ℃50 s,72 ℃50s,35个循环；最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存备用。

1.7　PCR反应条件的优化及特异性、敏感性、重复性试验

1.7.1　PCR反应条件的优化　为获得引物最佳的扩增效果，我们对引物的扩增条件进行了摸索和调整，即运用正交法，梯度性地改变变性温度和时间、退火温度和时间、延伸时间以及循环数等条件，最终确定了P1/P2的最佳循环扩增条件，在后续试验中均采用该相应条件。

1.7.2　特异性试验　以PCV-2细胞毒毒株、PCV-1、CSFV、PRRSV、PRV和PPV提取的细胞总基因组进行PCR操作，验证该方法的特异性。

1.7.3　敏感性试验　将250 μL PCV-2型细胞毒提取DNA，用核酸测定仪确定其浓度为100 ng/mL，然后从100 ngDNA开始按10倍递增稀释至10－7，用该引物对进行PCR扩增，按上述方法进行PCR，验证其敏感性。

1.7.4　重复性试验　将PCV-2型细胞毒在相同条件下，重复进行5次以上DNA提取和PCR检测，以验证该方法的重复性。

1.8　PCR方法的应用(样品检测)

用本试验建立的PCR方法对采自陕西部分地区的病料进行PCR检测，按1.3的方法处理病料。采用病毒基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA，按1.6的方法进行PCR检测。

2　结果

2.1　PCR扩增

提取PCV-2细胞毒DNA，用引物对P1/ P2进行扩增，获得了与预期大小一致的493 bp的特异性目的条带(图1)。

2.2　PCR扩增条件的优化

引物P1/P2的最佳扩增条件为95 ℃ 5 min；94 ℃50 s,54 ℃50 s,72 ℃ 50 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。4 ℃保存备用。在后续试验中均采用该反应条件。

M.DNA标准DL 2 000；1.PCV-2扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000；1.Amplifiedproducts of PCV-2

图1　PCV-2的PCR扩增结果

Fig.1　PCR amplification of PCV-2

2.3　特异性试验

以PCV-2细胞毒、PCV-1、CSFV、PRRS、PRV和PPV提取的细胞总基因组为模板，同时用阴性PK-15细胞提取的DNA基因组作为阴性对照，进行PCR扩增。经10g/L琼脂糖凝胶电泳观察，发现只有PCV-2细胞毒PCR产物在500bp附近有一条与预计大小相符的条带，而PCV-1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV和阴性对照都没有条带(图2)。

M.DNA标准DL 2 000；1.PCV-2的PCR产物；2～7. PCV-1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV、阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000；1.PCR product of PCV-2 infected cells；2-7.PCRproducts of PCV1，CSFV，PRRSV，PRV，PPV and negative control

图2　不同样品的PCR扩增结果

Fig.2　PCRresults ofdifferent samples

2.4　敏感性试验

以PCV-2感染的PK-15细胞提取的DNA为模板，进行敏感性试验结果发现，引物对P1/P2可以检测出目的基因的最低DNA模板量为10－4ng (图3)。

2.5　重复性试验

按同样的方法分别进行将提取的DNA样品在相同条件下，重复5次PCR扩增，结果均能出现相同的检测结果。

2.6　PCR方法的应用

用本试验建立的PCR方法对采自陕西部分地区的211份病料进行PCR检测，结果发现108份病料呈阳性，阳性检出率为51.18%。各地病料PCV-2阳性检出率见表1。

M.DNA标准DL 2 000；1～10.PCV-2的DNA含量从100 ng/mL10倍递减到10－7ng/mL

M.DNA Marker DL 2 000；1-10.100 ng/mL to 10－7ng/mL DNA infected with PCV-2

图3　不同浓度的PCR扩增结果

Fig.3　PCR results ofdifferent concentrations

表1　不同地区病料PCV-2阳性检出率

Table 1　The positive rate of PCV-2 samples from different regions

3　讨论

在临床上，PCV-2引起疾病的临诊症状与CSFV、PRRS、PRV和PPV所引起的疾病的临床症状具有相似性，极易混淆，因此必须结合实验室检测来诊断。与病毒分离鉴定、间接免疫荧光技术和ELISA技术等相比，PCR技术具有操作简便、特异性和敏感性较高、快速等优点。本文设计了一对特异性的引物，用PCR方法扩增出了大约493bp的条带，对PCV-1、CSFV、PRRS、PRV、PPV和阴性对照使用该方法同样进行扩增检测，结果参考病毒无任何目的条带检出。表明用设计的引物进行PCR扩增具有良好的特异性。本研究所建立的PCR方法可以检测出目的基因的最低DNA模板量为10－4ng，检测灵敏度很高。多次重复性试验能得到同样的结果。证明本文所建立的针对PCV-2的PCR快速检测方法具有很好的敏感性和重复性。该方法避免了PCV-2检测中的假阳性问题，不仅适用于发病猪群中PCV-2感染的检测，同时也为对健康猪群的PCV-2感染情况、猪用疫苗PCV-2的污染情况的调查奠定了实验室基础。该方法也可用于大规模的PCV-2病料检测，为我国PCV-2疫情监测提供了技术支持。

本文设计的PCR检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好的特点。用该方法对陕西部分地区猪场中临床送检的211份组织样品进行检测，其中108份样品能扩增出与预期大小相符的条带，阳性率达51.18%。杨增岐等于2006年首次报道本病在陕西省的发生，短短2年时间感染率由32.9%上升为51.18%，这值得我们高度重视。各养猪场都应做好PCV-2的预防和控制。

对陕西省汉中市、宝鸡市、杨陵区等地病料进行PCV-2的PCR检测后发现，各地的阳性检出率差距较大，从85.71%到36.36%不等，结果显示各地养猪场存在不同程度的PCV-2感染。这与病料采集数和不同地区病料的采集、保存情况不同有关。各地PCV-2的流行没有明显的地域性，而与养殖场有密切联系，提示我们，养猪场在PCV-2的预防和防疫工作中应加强管理，并确保引种安全。