不同添加成分对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

摘　要：卵母细胞体外成熟是胚胎工程中的一项基础性研究。试验比较了不同添加成分对绵羊卵母细胞的体外成熟及其后续发育的影响。分析了EGF不同添加量、FSH∶LH的不同配比和不同大小卵泡的卵泡液对绵羊卵母细胞的体外成熟的影响。结果表明，①添加30ng/mL EGF的成熟率显著高于其他试验组(85.0% VS60.0%，71.7%，72.7%，P<0.05)，并可提高绵羊孤雌激活胚的囊胚发育率；②成熟液中添加FSH 1 μg/mL，LH 5.0IU/mL成熟率最高；③在绵羊卵母细胞成熟液中添加3%绵羊大卵泡液，在成熟率上极显著高于20%小卵泡液的添加组(78.6% VS36.5%，P<0.01)，显著高于3%小卵泡液的添加组和未添加组(78.6% VS 60.0%，67.5%，P<0.05)。

关键词：绵羊；体外成熟；孤雌激活；卵泡液

哺乳动物卵母细胞体外成熟研究始于1935年，Pincus和Enzmann报道从兔卵巢卵泡中释放出的卵母细胞经过培养能够自发地成熟。Edwards于1965年首次进行了牛的未排卵子的体外培养，拉开了体外胚胎生产研究的序幕，接着卵母细胞体外成熟先后在小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猪、山羊、绵羊、牛、恒河猴等动物和人上取得成功。卵母细胞体外成熟是指通过活体取卵或从屠宰家畜或其他屠宰动物获得卵母细胞，在一定的实验条件下，模拟动物体内生理生化环境，使卵母细胞恢复减数分裂的技术。虽然经过了几十年的的研究，取得了一些比较理想的结果，但它毕竟是模拟动物体内的生理生化环境，总有一些因素影响该项技术的发展，需要进一步的深入研究。为此，本文从卵母细胞体外成熟液中生长因子的添加、激素的配比和卵泡液的添加等方面来分析绵羊卵母细胞的体外成熟的影响因素。

1　材料与方法

1.1　试剂

TCM-199购自Gibco公司外，FSH、LH购自中国科学院动物研究所，其余试剂均购自Sigma公司。

1.2　绵羊卵巢的采集、运输及绵羊卵母细胞的采集、体外成熟

将在新乡市屠宰场采集的绵羊卵巢置于25 ℃～30 ℃、含有双抗的生理盐水中，4 h～6h内运回实验室。用抽吸法采集卵丘卵母细胞复合体(COCs)，在实体显微镜下拣出A级、B级COCs，用H-M199洗3次，然后移入成熟液中，按照试验设计方案进行体外成熟培养。培养条件为30mm培养皿(500 μL)、38.5 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度。

1.3　绵羊卵泡液的收集

用注射器分别吸取直径在2 mm～5 mm、5 mm～10 mm卵泡的卵泡液，5个以上卵巢的卵泡液混合均匀，4 000r/min离心10 min，吸取上清夜，56 ℃水浴灭活30 min,0.22 μm滤膜过滤，置－20 ℃冻存备用。

1.4　卵母细胞的孤雌激活

选择排出第一极体的卵母细胞，在含5 μmol/L离子霉素的成熟培养液中OM液中激活5 min，然后在含2 mmol/L6-DMAP和5 μmol/L细胞松弛素(CB)的OM液中培养4 h，用培养液洗3次后进行培养。

1.5　孤雌激活胚的体外培养

重组胚激活后，转移到SOFaa胚胎培养液中，在38.5 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度下进行体外培养，每48 h换液1次，第72小时加100 mL/L的第7天发情牛血清培养，第7天至第9天检查记录囊胚发育情况。

1.6　试验设计

试验1：分析在卵母细胞培养液中成熟过程中添加EGF对卵母细胞的成熟及其后继发育的影响，在成熟培养液中分别加入10、30、50ng/mL的EGF，并设立对照组，统计卵母细胞成熟率、成熟卵母细胞孤雌激活后卵裂率和囊胚发育率。

试验2：分析在成熟过程中添加不同FSH和LH的配比对卵母细胞的成熟及其后继发育的影响，1 mL成熟液中FSH和LH配比分别为0.5μg∶1 IU,1 μg∶5 IU,5 μg∶10 IU,10 μg∶15 IU。

试验3：在卵母细胞成熟液中加入3%的大卵泡液(5 mm～10 mm),3%的小卵泡液(2 mm～5mm)，20%的小卵泡液。比较不同大小的卵泡的卵泡液对绵羊卵母细胞体外成熟的影响。

1.7　试验数据的统计分析

所有试验重复3次以上，试验数据用χ2进行差异显著性分析。

2　结果

2.1　EGF对卵母细胞成熟及孤雌发育的影响

在卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的EGF对细胞体外成熟影响结果见表1。

表1　不同EGF添加量对卵母细胞成熟及孤雌发育的影响

Table 1　The effects ofEGF concentrations on sheep oocyte maturationinvitroand the parthenogentic embryo development

注：同一列不同字母之间差异显著(P<0.05)。

Note：Values in same columns with different letters mean(P<0.05) significant difference.

在卵母细胞成熟培养中添加30 ng/mL的EGF与添加10、50 ng/mL和对照组对绵羊卵母细胞的成熟存在显著差异(P<0.05)，结果表明添加30ng/mL的EGF能提高绵羊卵母细胞的成熟率。同时，结果也表明添加EGF能够提高绵羊卵母细胞孤雌激活以后的卵裂率和囊胚率，试验组与对照组存在显著差异(P<0.05)，尽管添加10、30、50 ng/mL之间无显著差异(P>0.05)，但以添加30 ng/mL EGF时的囊胚发育率最高，结果见表1。试验表明添加30ng/mL的EGF对绵羊卵母细胞成熟有促进作用，并可提高绵羊孤雌胚的囊胚发育率。

2.2　不同激素配比对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

在绵羊卵母细胞体外成熟液中，添加不同激素配比对绵羊卵母细胞体外成熟的结果见表2。

由表2可以看出，成熟液中不同激素配比对绵羊卵母细胞的体外成熟有很大影响。其中FSH∶LH为0.5 μg/mL∶5.0 IU/mL和1μg/mL∶5.0 IU/mL两组的成熟率较高，与其他组差异显著(P<0.05)，其他组之间差异不显著(P>0.05)。

表2　不同激素配比对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

Table 2　The effects of the concentration of FSH and LH on sheepoocyte maturationinvitro

注：同一列不同字母之间差异显著(P<0.05)。

Note：Values in same columns with differentletters mean significantdifference(P<0.05).

2.3　不同直径绵羊卵泡的卵泡液及不同浓度的卵泡液对绵羊卵母细胞成熟及孤雌发育的影响

在卵母细胞成熟培养液中添加不同直径绵羊卵泡的卵泡液及不同浓度的卵泡液对卵母细胞体外成熟的结果见表3。

表3　不同直径绵羊卵泡的卵泡液对绵羊卵母细胞成熟及孤雌发育的影响

Table 3　The effects of the addition of different diameter sheepfollicular fluid and different concentrations on sheep oocytematurationinvitroand the parthenogentic embryo development

注：同一列不同字母之间差异显著(P<0.05)。

Note：Values in same columns withdifferentletters mean significantdifference(P<0.05).

添加不同种类大小的卵泡液可以看出，绵羊大卵泡液添加组在成熟率上极显著高于20%小卵泡液添加组(P<0.01)和对照组，3%小卵泡液显著高于20%小卵泡液的添加组(P<0.05)；3%绵羊大卵泡液添加组在卵裂率上显著高于其他组(P<0.05)，但四组在囊胚率上差异不显著，但绵羊大卵泡液添加组要高于其他组。

3　讨论

3.1　EGF对卵母细胞成熟的影响

自20世纪90年代以来，为了提高卵母细胞体外的成熟率及体外成熟卵母细胞的质量，研究者通过添加细胞因子或生长因子来改善卵母细胞微环境以促进胞质发育，提高体外成熟卵母细胞的进一步发育能力。本研究将表皮生长因子(EGF)应用于绵羊卵母细胞的体外成熟培养液中，研究其不同添加量对体外成熟卵母细胞的影响。现证实加入EGF不仅能促进卵巢颗粒细胞增殖，促进卵母细胞成熟，而且还对胚胎的分化和囊胚的形成具有一定作用，这与WoodS A等的结果一致。Lonergan P等和Harper KM等也证明EGF不仅可以促进牛卵母细胞体外成熟，而且可提高体外成熟卵母细胞进一步形成囊胚的比例。EGF受体是一种酪氨酸激酶，当EGF与之结合后可以促进多肽类物质磷酸化，进一步激活卵母细胞胞质成熟所需的酶系列，有利于卵母细胞的IVM。其可能的机制：①卵丘细胞的存在可增加卵母细胞表面积与体积之比，增加众多小分子物质如EGF进入卵母细胞；②卵丘细胞微绒毛可穿过透明带与卵母细胞形成缝隙连接和桥粒，有助于卵母细胞代谢过程中重要物质的转运；③颗粒细胞可通过旁分泌信号直接作用于卵母细胞，表明卵母细胞和颗粒细胞共培养有助于卵子发育；④Flood认为EGF提高牛囊胚发育率是因为EGF与滋养层细胞结合有关，这种结合可能激活滋养层细胞膜上的Na＋/H＋交换。这些都提示在体外培养中EGF的添加，可调节卵丘细胞对FSH、LH的反应性，通过卵丘细胞来促进卵母细胞胞质的发育，提高体外成熟率和胚胎的体外发育能力。

3.2　FSH/LH不同激素配比对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

激素是哺乳动物卵母细胞核成熟的基本调节物。FSH能促进颗粒细胞加速有丝分裂并分泌卵泡液，还能诱导卵丘细胞芳香化作用，以及合成各种肽类并获得LH受体，在调节卵丘细胞分化中起着主要作用。LH可使卵母细胞恢复减数分裂。因排卵前卵泡卵母细胞的成熟分裂恢复与LH峰的时间基本一致，由此认为，LH是卵母细胞体内成熟的诱导者。有报道表明，FSH和LH配合使用比单用FSH或LH要好。本试验在不同的FSH、LH浓度搭配试验组中，绵羊卵母细胞体外成熟后第一极体排出率有差异，排出率最高的试验组与排出率最低的试验组相比差异显著(P<0.05)。

3.3　不同直径卵泡的卵泡液对绵羊卵母细胞成熟及孤雌发育的影响

绝大多数哺乳动物在胚胎期或刚出生时，卵母细胞即开始减数分裂，并停留于第一次减数分裂双线期，其内可见明显的生殖泡(GV)，并可在此阶段持续数年之久。当将卵泡中GV期卵母细胞移至体外，在没有促性腺激素的条件下可自发性地恢复减数分裂8],。说明卵泡液存在某种可以抑制卵母细胞成熟的因子，卵母细胞减数分裂抑制因(oocyte maturationinhibitor，OMI)即可使卵母细胞停滞于GV期。早期，许多学者均认为这种观点主要来自用中小卵泡的卵泡液对卵母细胞体外培养的研究。

卵泡液内的成分随着卵泡的大小变化而变化。本文研究发现，添加2 mm～5mm的卵泡的卵泡液20%到成熟液中，对卵母细胞的成熟有明显的抑制作用，绵羊3%大卵泡液添加组在成熟率上显著高于20%小卵泡液添加组(P<0.05)，与对照组、3%小卵泡液添加组差异不显著。绵羊大卵泡液添加组在卵裂率上显著高于其他组(P<0.05)；4组在囊胚率上差异不显著，但绵羊大卵泡液添加组要高于其他组。这就证明Stato E等的研究结果，卵泡液内即含有抑制核成熟的颗粒细胞分泌因子，又含有促进胞质成熟的内膜细胞分泌因子。另外，Naito K等报道，将卵泡液添加到含有促性腺激素的成熟液中，可逆转猪卵泡液对卵母细胞核成熟的抑制效应，增强猪卵泡液对卵母细胞胞质成熟的促进效应。本文研究也有相似结果。因此，笔者认为今后的研究如能通过免疫学方法除去卵泡液中这些抑制物质，则可望进一步完善卵泡液对卵母细胞IVM的促进作用。

添加30 ng/mL的EGF对绵羊卵母细胞成熟有促进作用，并可提高绵羊孤雌胚的囊胚发育率；FSH∶LH为1 μg∶5.0IU的激素配比可以获得最佳的成熟效果；在绵羊卵母细胞成熟液中添加3%绵羊大卵泡液可以促进绵羊卵母细胞体外成熟。