向硫酸庆大霉素结合物的制备和免疫原性研究

摘　要：将硫酸庆大霉素与大肠埃希菌血清抗体用化学修饰剂进行偶联，再经适当的化学方法处理，按照制剂学原理制备成靶向硫酸庆大霉素，经电镜检测，可以清楚的看到抗体球蛋白上附着的硫酸庆大霉素药物颗粒。应用间接ELISA法检测靶向硫酸庆大霉素结合物的免疫原性。结果表明，结合物存在微弱的免疫原性，但与大肠埃希菌血清抗体相比，免疫原性已经大为减弱，说明靶向硫酸庆大霉素复合物中，化学修饰剂不仅扮演偶联物的角色，还减弱了结合物中大肠埃希菌血清抗体的免疫原性，对靶向硫酸庆大霉素结合物的药动学和药效学几乎无影响。

关键词：靶向硫酸庆大霉素；免疫原性；间接ELISA

靶向制剂亦称靶向给药系统(targeting drug system，TDS or targeted drugdeliverysystem，TDDS)，是一类能使药物浓集定位于病变组织、器官、细胞或细胞内结构的新型给药系统。靶向治疗可使治疗部位的药物浓度明显提高，可减少用药量并使治疗费用降低，减少药物对全身的毒副作用。靶向制剂目前主要应用于人类治疗癌症药物中，在兽医临床尚未见有关报道。通过将硫酸庆大霉素与大肠埃希菌血清抗体偶联，制备出专一针对大肠埃希菌的兽用靶向硫酸庆大霉素结合物，由大肠埃希菌血清抗体寻找和捕捉大肠埃希菌，由硫酸庆大霉素抑制和杀灭大肠埃希菌，使其对大肠埃希菌进行“精确打击”，以此增强硫酸庆大霉素的抗菌作用。靶向药物中存在血清抗体，故进行免疫原性的测定，为该靶向药物应用于临床提供安全性依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　药物与试剂　硫酸庆大霉素原粉(湖南金方堂药业有限公司提供)，大肠埃希菌血清抗体(自制，用大肠埃希菌灭活疫苗免疫家兔制得)，酶标抗体(北京鼎国生物技术发展中心，批号Y2300140)，包被液(碳酸盐缓冲溶液)；封闭液(100mL/L小牛血清PBS溶液，调整pH至7.2)，洗涤液(PBST：0.05%Tween-20的PBS)，底物溶液(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液：取24.3 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液，25.7 mL 0.2mol/L Na2HPO4・12H2O，再加50 mL ddH2O。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多)；OPD(邻苯二胺)底物(由于此底物对光敏感，必须现配现用)；反应终止液(准确量取浓H2SO410 mL溶于80 mL DDW)。

1.1.2　实验动物　健康家兔9只，雌雄各半，体重1.50 kg～3.0 kg，购自湖南农业大学动物医学院。

1.1.3　实验仪器　电热恒温鼓风干燥箱，酶标板，酶标仪。

1.2　试验方法

1.2.1　靶向硫酸庆大霉素药液的制备　按适当比例称取化学修饰剂和硫酸庆大霉素原粉，加入到一定剂量的血清抗体中，再加生理盐水至45mL，按无菌操作法，在适宜的反应条件下搅拌，使之充分混合、溶解，于4 ℃冰箱中放置24 h后，弃去上清液，将沉淀用450mL生理盐水充分溶解，即制得靶向硫酸庆大霉素溶液，对其性状进行研究，进行电镜扫描，然后将制备的靶向药物放入冰箱冷藏备用。

1.2.2　免疫原性检测　参照文献选取9只家兔分为3组，一组注射靶向药物结合物水溶液，另外一组注射免疫大肠埃希菌血清抗体溶液，空白组注射生理盐水。在家兔背部皮内接种免疫1次，剂量为1mL，分点注射，接种家兔在适宜隔离条件下饲养。次日上午无菌操作心脏采血，分离血清，置56 ℃水浴箱中灭菌30 min，然后用0.3μm孔径的微孔滤膜过滤，分装；置－20 ℃保存。血清抗体的间接ELISA效价的检测：于酶标板中分别加入0.1mg/mL复合物和大肠埃希菌血清抗体的包被液，4 ℃的冰箱中，作用24 h。然后每孔加入新生牛血清200 μL /孔，于37℃的冰箱中作用48 h。从冰箱中取出酶标板，用PBS液连续冲洗5次，每次5 min，4 ℃保存备用。检测时将样品用PBS液作50μL的倍比稀释，依次从第1孔加到第12孔，再重复检测两份样品，以3份样品检测值的平均值为样品检测值。按照上述操作，加12孔(50μL/孔)健康非免疫家兔血清作为阴性对照组，加12孔(50μL/孔)生理盐水作为空白对照组，然后置于37 ℃的恒温箱中作用2 h。取出酶标板，用TPBS液连续冲洗5次，每次5min。加入酶标抗体(兔抗IgG)50 μL /孔，放入37 ℃恒温箱中，作用2 h，再用PBS液连续冲洗5次，每次5min。加底物溶液50μL/孔，避光作用10 min～15 min。加终止液50 μL/孔，终止反应，置于酶联免疫测定仪上测定结果。

2　结果

2.1　抗体对照和结合物扫描电镜观察结果

电子显微镜图片中，抗体经磷钨酸负染着色较浅，其形态、大小不一致。药物颗粒经磷钨酸负染着色较深，可以清楚的看见抗体球蛋白上附着的硫酸庆大霉素药物颗粒。抗体和靶向药物的扫描电镜结果见图1和图2。

①血清抗体；②硫酸庆大霉素

①Seral antibody；②Gentamycin sulfate

图1　血清抗体

Fig.1　Seral antibody

图2　结合物

Fig.2　The complexes

2.2　ELISA检测结果

靶向硫酸庆大霉素结合物的兔血清抗体、大肠埃希菌血清抗体的兔血清抗体、健康非免疫家兔血清和生理盐水(空白)各组的间接ELISA检测结果显示(表1)，健康非免疫家兔血清的间接ELISA检测OD值的平均值为0.108，本试验以健康非免疫家兔血清为阴性对照，因此，OD值0.108即为N值，然后根据P/N≥2可判定结合物的兔血清抗体的间接ELISA效价为1∶8；大肠埃希菌血清抗体的兔血清抗体的间接ELISA效价为1∶64。说明用相同浓度的结合物和大肠埃希菌血清抗体免疫家兔，大肠埃希菌血清抗体刺激家兔产生的免疫反应比复合物刺激家兔产生的免疫反应性强。

表1　ELISA结果记录表

Table 1　ELISAresult data

注：1.复合物免疫家兔制备的血清抗体；2.大肠埃希菌血清抗体免疫家兔制备的血清抗体。

Note：1.Seral antibodies of rabbits immunized with complex；2.Seralantibodies of rabbits immunized with against seral antibodyE.coli.

3　讨论

抗体蛋白与硫酸庆大霉素和化学修饰剂的耦合并不仅仅是简单的混合，而是形成了一种较为稳定的结构，在电镜下能清楚的看到结合物。至于结合物的结构及以什么样的化学键结合，还有待于进一步研究。

在本试验中，阴性对照的检测值是12份健康非免疫家兔血清检测值的平均值，这是由于在检测中，没有标准阴性血清，而间接免疫，非特异性反应较强，因此取多份健康免疫家兔血清检测值的平均值为阴性对照检测值。从检测数据中也可看出，健康免疫家兔血清检测值明显高于空白对照组的检测值，而健康免疫家兔血清检测值离散度较大。

本试验应用间接ELISA法检测了靶向硫酸庆大霉素结合物的免疫原性，表明结合物存在微弱的免疫原性，但与大肠埃希菌血清抗体相比，免疫原性已经大为减弱，这主要是因为靶向硫酸庆大霉素结合物中，化学修饰剂不仅扮演偶联物的角色，还减弱了结合物中大肠埃希菌血清抗体的免疫原性。靶向硫酸庆大霉素结合物的免疫原性很弱，其免疫血清抗体间接ELISA效价为1∶8，不足以与进入动物体内的靶向硫酸庆大霉素结合物发生强烈的免疫反应，从而对靶向硫酸庆大霉素结合物的药动学和药效学几乎无影响。