绵羊体外受精技术条件优化的研究

摘　要：探讨了卵泡液、受精时间和季节对绵羊卵母细胞体外培养效果的影响。从屠宰场采集羊卵巢，抽取卵巢表面2 mm～6mm的卵泡卵母细胞，进行体外成熟培养；卵母细胞成熟后，与处理后的精子共同培养进行受精。结果表明，在卵母细胞成熟培养液中添加绵羊卵泡液(SFF)组的卵裂率和囊胚发育率均优于添加同等浓度的牛卵泡液(BFF)组；受精22、18、12h组的卵裂率分别为64.85%、54.39%、48.72%，受精22 h和18 h组间差异显著(P<0.05)，受精22 h组和12 h组间差异极显著(P<0.01)。秋季绵羊体外受精的卵裂率和囊胚率均高于夏季，差异显著(P<0.05)，但秋季与春季相比差异不显著(P>0.05)。因此，进行绵羊卵母细胞体外成熟培养时，培养液中添加SFF；受精时，精卵共培养时间为22h的效果较好。在绵羊的繁殖季节秋季进行体外受精较春季和夏季的结果好。

关键词：卵母细胞；体外成熟；体外受精；卵泡液；季节；绵羊

近年来，牛体外受精(invitrofertilization，IVF)技术已逐步完善，有望解决优良胚胎来源匮乏的问题，并可降低胚胎移植成本，但绵羊体外受精技术还存在许多问题亟待解决。绵羊体外受精技术始于20世纪60年代，经过国内外学者长期的研究，直到1985年，才由日本学者花田章等获得绵羊体外受精后代。绵羊卵巢卵母细胞体外成熟(invitromaturation，IVM)及体外受精相关的影响因素有待进一步探讨。本试验分别对卵泡液、受精时间和季节等影响因素进行研究，以优化绵羊卵母细胞IVM和IVF体系。

1　材料与方法

1.1　仪器设备

二氧化碳培养箱(德国Heraeus，RS232)，体视镜(北京泰克)，电子天平(HANSEN，HR-182)，倒置显微镜(Olympus，IX71)，超纯水仪(德国申功)；35mm塑料培养皿、24孔培养板和96孔培养板由Nunc公司生产。

1.2　试剂

TCM-199、丙酮酸钠、碳酸氢钠和碳酸钠等由Sigma公司生产；雌二醇、促卵泡素(follicle-stimulatinghormone，FSH)、促黄体素(luteinising hormone，LH)为宁波激素制药厂生产。

1.3　卵泡液制备方法

用5 mL注射器抽取卵巢表面的卵泡(羊为6 mm以上，牛为8 mm以上)，将获得的卵泡液用10 mL无菌离心管以3 000r/min离心3 min，吸取上清液，过滤，置－20 ℃储存备用。

1.4　卵巢与卵母细胞采集和卵母细胞体外成熟培养

绵羊卵巢采自乌鲁木齐市华凌畜牧基地屠宰场。绵羊屠宰后立即取下卵巢，置于38℃的灭菌生理盐水(含100单位/mL青霉素和100单位/mL链霉素)中保存，2 h～6 h运回实验室。用38℃的灭菌生理盐水清洗卵巢3次～5次，用连有12号针头的10 mL注射器抽吸卵巢表面直径为2 mm～6mm卵泡。将抽取的带有卵母细胞的卵泡液置于直径60mm的平皿内静置，拣卵，选择包有1层以上的颗粒细胞未扩展且胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocytecomplexes，COC)进行体外成熟培养。羊卵母细胞体外成熟使用直径为35 mm的细胞培养皿，培养液量为2mL。卵母细胞成熟培养液为TCM199＋100 mL/L，卵泡液＋微量FSH和LH，培养条件为体积分数为5%的CO2,38.5 ℃，饱和湿度，成熟培养24 h。

1.5　精子获能处理和卵母细胞的体外受精

本试验使用的精子是颗粒冻精，由新疆畜牧科学院畜牧研究所生产。从液氮罐中取出颗粒冻精，直接将其投入带有2mL获能液的试管内进行体外获能。精子获能使用TALP液上游法上游15 min～20 min，取上清液以2 000 r/min离心3min，去除上清液，调整精子密度至6×106个/mL～9×106个/mL。精卵共孵育在96孔培养板内。精卵混合时间记为第0天。

1.6　早期胚胎的体外培养

受精后，将卵子移入24孔培养板中进行培养，培养液量为1 mL。第2天观察卵裂率，第6天～第7天观察囊胚率。培养过程中，每48h半量换液。培养条件均为体积分数为5%的CO2、38.5 ℃饱和湿度。

1.7　试验设计

试验1：比较牛卵泡液(bovine follicular fluid，BEF)和绵羊卵泡液(sheep follicularfluid，SFF)对绵羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。分别在卵母细胞成熟液中添加100 mL/L的SFF和BFF，培养24h后进行IVF，观察卵裂率和囊胚率。

试验2：比较精卵共培养时间(12、18、22、26 h)对卵母细胞体外受精的影响。在成熟液中添加100mL/L的SFF，卵母细胞成熟培养24 h后，精卵共培养时间分别为12、18、22、26 h，观察卵裂率和囊胚率。

试验3：比较季节(春季、夏季和秋季)对绵羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。在培养液中添加100mL/L的SFF，卵母细胞成熟培养24 h，精卵共培养22 h，观察卵裂率和囊胚率。

1.8　统计分析

本试验结果均用SPSS软件进行统计分析。

2　结果

2.1　牛羊卵泡液对绵羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

在成熟液中分别添加SFF和BFF，卵母细胞成熟培养24 h，精卵共培养22 h，结果见表1。

表1　成熟液中添加卵泡液对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

Table 1　Effects of follicular fluid added to maturation medium onIVM and IVF

注：同列比较，标有不同小写表示差异显著(P<0.05)。

Notes：Values in same columnswith different small letters meansignificant difference(P<0.05).

由表1可以看出，在成熟培养液中添加SFF组和BFF组的卵裂率分别为65.23%和60.43%，差异不显著(P>0.05)；囊胚率分别为26.16%和17.11%，差异显著(P<0.05)。

2.2　精卵共培养时间对卵母细胞体外受精的影响

在成熟液中添加SFF，卵母细胞成熟培养24 h，精卵共培养时间分别为12、18、22、26 h，结果见表2。

表2　精卵共培养时间对卵母细胞体外受精的影响

Table 2　Effects of sperm-oocyte co-cuture time on IVF results

注：同列比较，标有不同小写表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P< 0.01)。

Notes：Values in same columnswith different small letters meanP<0.05；with different capital letters meanP<0.01.

由表2可以看出，受精22 h组的卵裂率和囊胚率均优于受精12 h组、18 h组和26 h组。受精22 h组、18 h组和12h组的卵裂率分别为64.85%、54.39%和48.72%，受精22 h组和18 h组间差异显著(P<0.05)，受精22 h组和12 h组间差异极显著(P<0.01)。受精22 h组的囊胚率与受精26 h和18 h组相比均为差异显著(P<0.05)，但受精12 h、18 h和26 h之间的囊胚率差异不显著(P>0.05)。

2.3　季节对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

在培养液中添加100 mL/L的SFF，卵母细胞成熟培养24 h，精卵共培养22 h，结果见表3。

表3　季节对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

Table 3　Effects of seasons on IVM and IVF

注：同列比较，标有不同小写表示差异显著(P<0.05)。

Notes：Values in same columnswith different small lettersmeansignificant difference(P<0.05).

由表3可以看出，秋季的卵裂率和囊胚率均高于夏季，差异显著(P<0.05)，但秋季与春季相比差异均不显著(P>0.05)。

3　讨论

3.1　卵泡液对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

在成熟培养液中添加卵泡液对卵母细胞的体外成熟有明显的促进作用。现已证实，卵泡液中含有来自卵母细胞及颗粒细胞的分泌因子，如转化生长因子(transforminggrowth factor，TGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactor，IGF)等，这些分泌因子对牛卵母细胞的细胞质成熟具有促进作用。

有研究表明，在成熟液中分别添加100 mL/L胎牛血清(fetal cattle serum，FCS)(血清对照组)、200mL/L山羊卵泡液(goat follicular fluid，GFF)、200 mL/L SFF和200mL/L骆驼卵泡液(camel follicular fluid，CFF)用于牛卵母细胞体外成熟培养，培养24h后，添加异种卵泡液(GFF、SFF、CFF)实验组，牛卵母细胞的成熟率虽有所下降，但与对照组差异不显著(P>0.05)。在培养液中添加30 mL/L大卵泡液(大于10 mm)、50 mL/L发情牛血清(oestres cattleserum，OCS)及微量的FSH和LH，其第一极体率和卵裂率分别达到78.20%和71.69%，这说明在培养液中添加一定量卵泡液，并配合一定量的激素可促进卵母细胞成熟及其后期发育。在牛的体外成熟液中添加来源于不同大小卵泡的卵泡液均可促进成熟，添加100mL/L来源不同大小卵泡的混合BFF可以促进卵母细胞的受精以及受精后的发育。

本试验在卵母细胞成熟培养液中添加100mL/L的异种卵泡液(BFF)培养绵羊卵母细胞，卵裂率有所下降，但与添加同种卵泡液(SFF)组相比差异不显著(P>0.05)。这与孙风俊等在成熟液中添加人卵泡液培养绵羊卵母细胞的结果一致。说明卵泡液对羊卵母细胞的体外成熟没有种间特异性，添加适当浓度的异种卵泡液能取得与血清相当的效果。在实际应用中，以牛的卵泡液最容易获得，可在牛、羊胚胎体外生产中推广应用。

3.2　精卵共培养时间对卵母细胞体外受精的影响

精卵共培养时间通常与受精液体系有关，BO(Brackett & Oliphant)液受精时间为6 h～8h，Tyrode溶液(或TALP液)液则需要18 h～24h。本试验使用Tyrode液上浮法对精子进行分离，分别对精卵共培养时间做了比较，结果显示，最佳精卵共培养时间为22h，其卵裂率和囊胚率分别达到64.85%和26.06%。虽然精卵共培养12h的卵裂率(48.72%)有所下降，但是囊胚率却与前者差异不显著(P>0.05)。精卵共培养26 h组的囊胚率为17.11%，与精卵共培养12 h组相比差异显著(P<0.05)。说明缩短受精时间也同样可获得较高的囊胚率，但延长受精时间，胚胎发育能力有下降趋势。

有研究发现，如果精卵共培养时间大于3h，颗粒细胞可产生大量的氧化物质使透明带变硬。精卵共培养时间过长，精子的代谢产物如活性氧族(reactive oxygenspecies，ROS)、氧自由基等对胚胎的形态发育产生不利影响。精子和卵子共同培养期间，大量已获得受精能力的精子围绕着卵冠丘的复合体、高浓度的精子代谢产物以及因精子穿透卵丘而驱散的颗粒细胞、部分退化和死亡的精子，可能析出一些不利于胚胎发育的物质。

3.3　季节对卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

多数绵羊品种属季节性发情的动物，不同季节采集到的卵巢卵母细胞生理活性不同，可能对体外成熟及体外受精结果造成一定的影响。本试验取材于屠宰场，羊主要来自农牧区，试验结果显示，秋季体外培养的效果最好，春季次之，春季和秋季明显优于夏季。笔者认为可能原因是秋季水草丰盛，气温适当，羊的膘情好；羊处于繁殖季节，卵巢上卵泡发育较好，此时采集的卵母细胞质量好，培养效果较好；夏季虽然牧草丰富，但是由于天气炎热，羊处于热应激状态，采食量减少，卵巢活性差，培养效果较差。孙桂金等研究表明，发情季节较乏情季节有大量的卵泡生长，发情季节体内的FSH、LH和雌二醇高于乏情季节；发情季节采集到的卵母细胞经体内激素作用，卵母细胞内产生了更多的激素受体，在体外培养中更易于成熟。

本试验表明，春秋两季进行绵羊卵母细胞体外培养和体外受精，培养条件为38.5 ℃、体积分数为5%的CO2和饱和湿度，成熟培养24 h，精卵共培养22 h，在成熟培养液中加100mL/L的SFF的效果要好于添加同等浓度BFF，但秋季效果优于春季。