通用基因芯片对奶牛乳房炎主要致病菌的检测

摘　要：应用生物信息学手段和查阅文献资料设计了金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、绿脓杆菌、停乳链球菌、乳房链球菌6种奶牛乳房炎主要致病菌的通用引物和金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌的寡核苷酸探针及无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌的特异引物，并用这3种特异引物扩增片段的纯化产物作为这3种链球菌的检测探针。在引物对样品中细菌的相应基因片段扩增的同时进行靶基因的生物素标记，扩增的产物与硝酸纤维素膜上的探针进行杂交，酶联、显色后根据芯片扫描仪的判读结果来确定奶牛乳房炎致病菌感染的种类。结果表明，建立的以16S rDNA为对象的基因芯片技术可以快速的检测出以上6种细菌，整个检测过程需要6 h～7h，灵敏度高，特异性好，能快速的对奶牛乳房炎的主要致病菌做出诊断。

关键词：基因芯片；通用引物；奶牛乳房炎；致病菌

奶牛乳房炎是造成奶牛业经济损失最严重的疾病之一，主要由多种致病菌感染引起，它不仅造成重大的经济损失，还影响到乳的品质，危及人的健康。常规的检测方法和PCR法在奶牛乳房炎主要致病菌的检测鉴定方面都存在不同程度的局限性。基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的一种检测手段，已在药物研发、突变检测、食品检测、中药研究及分子作用机理、临床微生物学、基因表达检测及环境监测等领域发挥着重要作用。本文利用基因芯片高通量、并行检测分析的特点，建立了一套相对快速、高效、同时检测和鉴定奶牛乳房炎主要致病菌的方法。它以在细菌分类学上具有重要意义的16S rDNA为主要靶基因，设计一套用于检测和鉴定不同属种的寡核苷酸探针，探针以一定方式固定在硝酸膜上，制成低密度基因芯片，利用通用引物对靶基因扩增和标记之后，扩增产物与基因芯片在适当条件下杂交，根据杂交结果就能达到鉴别细菌属种的目的。本研究中，选用金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌6种奶牛乳房炎主要致病菌为研究对象，设计了金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌的寡核苷酸探针及无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌3种链球菌的共有探针，由于16SrDNA的序列保守性，3种链球菌在通用引物扩增的基因片段内序列几乎完全相同，因此又设计了3种链球菌的特异引物，并用这3种特异引物扩增的片段的纯化产物作为这3种链球菌的检测探针，实现了对3种链球菌的鉴别。

1　材料与方法

1.1　菌株来源

无乳链球菌、金黄色葡萄球菌购自中国兽医药品监察所，大肠埃希菌、绿脓杆菌由山东澳兰百特生物工程研究院保存，停乳链球菌、无乳链球菌、乳房链球菌由山东农业大学赵宏坤教授惠赠。

1.2　主要试剂和仪器

dNTPs(deoxynucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸)购自Promega公司，TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer、MgCl2购自Sangon公司，Biotin-11-dUTP(2′-deoxyuridine-5′-triphosphate-5′-allylaminebiotion，2′-脱氧尿嘧啶-5′-三磷酸-5′-丙烯氨基生物素)购自ENZO公司，鲑鱼精DNA来自Sigma公司。PCR仪为Gene公司产品，点样仪、杂交仪、扫描仪均为自行设计委托厂家制造，台式高速冷冻离心机由军事医学科学院研制，DA620s型紫外分光光度计为棱光公司产品。硝酸纤维素膜购自北京化工大学。

1.3　引物和探针的设计与合成

利用DAMBE软件对检索得到的相关的16 S rDNA序列进行序列对齐，得到碱基对齐图和聚类分析的结果。根据碱基对齐图划分出16 SrDNA的恒定区和可变区。并根据查阅文献，筛选出针对真细菌特异性最好的一对通用引物，并通过查阅文献和BLAST查询得到3种链球菌的特异引物，找出16 S rDNA碱基对齐图上通用引物PCR扩增的370bp区域内所有可能用作探针的寡核苷酸序列，经过筛选后GenBank中进行BLAST查询，找出特异性最好的进行合成(如表1)。引物由北京赛百盛生物工程公司合成，探针由上海生工生物工程技术有限服务公司合成。

表1　试验中使用的探针和引物

Table 1　Probes and primers used in this study

注：1.真细菌共有探针；2.G＋菌共有探针；3.G－菌共有探针；4.链球菌属共有探针；5.大肠埃希菌探针；6.金黄色葡萄球菌探针；7.绿脓杆菌探针；8.无乳链球菌探针引物；9.乳房链球菌探针引物；10.停乳链球菌探针引物；11.阳性探针；12.通用引物。

Note：1.All bacteria probe；2.All Gram positive bacteria probe；3.AllGram negaitive bacteria probe；4.Streptococcusprobe；5.Escherichiacoliprobe；6.Staphylococcusaureusprobe；7.Pseudomonasaeruginosaprobe；8.Primers ofS.agalactiaeprobe；9.Primers ofS.uberisprobe；10.Primers ofS.dysgalactisaprobe；11.Positive probe；12.Universal primers.

1.4　基因探针的排列

表1中列出的探针根据效能可分为5类：第1类为通用探针，其作用是能够与所有真细菌杂交，为1号探针；第2类是区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的探针，为第2,3号探针；第3类是链球菌属共有探针，为第4号探针；第4类是种特异性探针，包括第5、6、7、8、9、10号探针；第5类是阳性对照探针，为第11号探针。另外，12号为点蓝，13号为阴性对照，其排列设计如表2。

表2　探针在阵列中的排布示意图

Table 2　Layout of the probes

注：1.真细菌共有探针；2.G＋菌共有探针；3.G－菌共有探针；4.链球菌属共有探针；5.无乳链球菌探针6.大肠埃希菌探针；7.停乳链球菌探针；8.金黄色葡萄球菌探针；9.乳房链球菌探针；10.铜绿假单胞菌探针；11.阳性对照探针；12.点蓝；13.阴性对照探针。

Note：1.All bacteria probe；2.All Gram positive bacteria probe；3.AllGram negative bacteria probe；4.S.probe；5.S.agalactiaeprobe；6.E.coliprobe；7.S.dysgalactisaprobe；8.S.aureusprobe；9.S.uberisprobe；10.Pseudomonasaeruginosa probe；11.Positive probe；12.Note；13.Negative probe.

1.5　检测靶基因的扩增

1.5.1　标准菌株的培养、鉴定和DNA提取　将真空冷冻干燥保存的细菌接种于相应的肉汤中，37 ℃培养24h后转种至相应的选择性平板培养基，又经过37 ℃培养24h，对生长在选择性平板培养基的菌落进行形态学鉴定。挑取鉴定的单个菌落接种到斜面上，再经过37 ℃培养24h后，挑取一环菌，研磨、振荡、混匀于100 μL纯水上，煮沸10 min，10 000 r/min离心1 min，吸取上清液2μL用于PCR扩增。

1.5.2　PCR扩增和样品标记　采用生物素Biotin-11-dUTP标记，即用部分Biotin-11-dUTP代替部分dTTP(通常Biotin-11-dUTP∶dTTP＝3∶1)掺入PCR体系。扩增反应体系总体积30μL，内含dNTP(各2.5 mmol/L)4 μL，Biotin-11-dUTP4 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL、10×PCR buffer 3 μL、MgCl2(25 mmol/L)4 μL，上下游引物(50 pmol/μL)各0.5 L，再加入模板2μL，后用石蜡油覆盖，置于DNA扩增仪。首先94 ℃ 5 min，再按94 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,55 ℃ 30s的顺序，共35个循环，最后72 ℃ 5 min。

1.6　基因芯片的制备

利用3种链球菌的特异引物经PCR获得扩增片段，用PMD18-T载体构建重组质粒，连接转化大肠埃希菌感受态细胞，筛选重组克隆，经酶切、PCR扩增及测序进行鉴定后，对扩增产物纯化，并使其浓度至200ng/μL，将合成的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌探针也稀释至200ng/μL，后采用手工点样的方式将探针点在硝酸纤维素膜上，凉干后置于干燥箱内，80 ℃烘烤2 h，保存备用。

1.7　杂交检测

加450 μL预杂交液于杂交槽中，42 ℃杂交40 min。然后取20 μLPCR产物于1.5 mL的离心管中，100 ℃ 10min，－20 ℃ 5min，后加杂交液400 μL，混匀于杂交槽内，52 ℃ 1 h。再分别用2×SSC(sodiumchloride/sodium citrate，氯化钠/柠檬酸钠),0.1×SDS(sodium dodecylsulfate，十二烷基硫酸钠)和0.1×SSC,0.1×SDS各洗3次。400 μL的30 g/L BSA于42 ℃封闭30min，用400 μL酶联液(内含1.6 μL AV-AP)42 ℃酶联20 min，用洗涤液洗涤3次后，加入显色液常温显色3min～5 min，后用蒸馏水冲洗，终止显色。

1.8　杂交结果的检测与分析

采用610芯片检测仪对芯片进行扫描，并用软件进行结果分析。根据大量样品分析，设置读数0.1以下为阴性，0.2以上为阳性，两者之间为可疑。

2　结果

2.1　通用引物扩增的广谱性试验

采用设计的通用引物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、绿脓杆菌、停乳链球菌、乳房链球菌6种奶牛乳房炎主要致病菌及酵母菌进行扩增，6种致病菌同在370bp处见一清晰条带，而酵母菌呈扩增阴性(图1)，证明该引物为真细菌所共有，与文献报道相符。

M.DNA标准DL 2000；1.无乳链球菌；2.金黄色葡萄球菌；3.大肠埃希菌；4.乳房链球菌；5.绿脓杆菌；6.停乳链球菌；7.酵母菌；8.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000；1.S.agalactiae；2.S.aureus；3.E.coli；4.S.uberis；5.Pseudomonasaeruginosa；6.S.dysgalactisa；7.Yeast；8.Negative control

图1　通用引物扩增的广谱性

Fig.1　Specificity of the universal primers

2.2　细菌菌液灵敏度试验

用LB斜面转接金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌，37 ℃培养12 h，用接种环刮取一环到5 mL PBS(phosphate bufferedsaline，磷酸盐缓冲液)中，然后做10倍系列稀释直至10－9，利用平板涂抹法对2种细菌进行菌落计数，取各个稀释度进行芯片杂交实验，观察细菌系列稀释后芯片杂交灵敏度。经过平板计数，计算出菌液原始浓度。金黄色葡萄球菌为2.55×107cfu/mL(clone forminy unit，菌落形成单位)，绿脓杆菌为2.0×107cfu/mL，对于2种菌液来说，基因芯片检测的灵敏度分别可达2.55 cfu/mL和2.0 cfu/mL。

2.3　特异性试验

分别提取6种致病菌标准菌株的核酸，用引物扩增的同时进行生物素标记，扩增产物分别与芯片进行杂交，扫描检测后仅在相应的位点出现阳性信号，图2为6种细菌的典型杂交图谱。

1.大肠埃希菌；2.乳房链球菌；3.停乳链球菌；4.无乳链球菌；5.绿脓杆菌；6.金黄色葡萄球菌

1.E.coli；2.S.uberis；3.S.dysgalactisa；4.S.agalactiae；5.P.aeruginosa；6.S.aureus

图2　6种细菌的典型杂交图谱

Fig.2　Typical hybridization results of sixspecies of bacteria

2.4　样品中多个目的菌同时检测

对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、无乳链球菌3种标准菌的菌液编号后，经过平板计数，计算出菌液原始浓度。金黄色葡萄球菌为2.5×107cfu/mL，大肠埃希菌为3.5×107cfu/mL，无乳链球菌为6.0×106cfu/mL，并进行1,2,3，(1＋2)，(1＋3)，(2＋3)和(1＋2＋3)组合，混合液中各组分的浓度尽量接近，判断芯片多样品检测的可行性。该芯片对含有一种和两种致病菌的菌液能有效的检出，但对于含3种混合菌的菌液则较难检测。

3　讨论

本研究利用16 SrRNA为细菌所共有的特性，设计并合成了通用引物。这一对引物能扩增各种真细菌的DNA，我们用它来检测无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌的标准菌株，同在370bp处见一清晰条带，而酵母菌呈扩增阴性，证明该引物为真细菌所共有，具有广谱性，并与文献报道相符合。特异性试验中，大肠埃希菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌通过3条探针检测到种的水平，无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌则用了4条探针。链球菌属共有探针、大肠埃希菌、绿脓杆菌都表现出了较好的杂交图谱，但金黄色葡萄球菌寡核苷酸探针杂交时则出现了与其它菌株的交叉反应，通过碱基对齐图可发现，其探针与其他菌株碱基差别很小，仅1～2碱基。在细菌菌液灵敏度试验中，由于金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌是很难破壁的，而且细菌裂解物对PCR影响很大，不同细菌和不同的裂解、扩增条件对PCR扩增灵敏度都将产生很大影响，也直接影响着杂交结果，因此，基因杂交的检测灵敏度也受到以上因素的影响。从一定程度上来说，PCR的扩增能力是影响基因杂交检测灵敏度的重要因素。在样品中多个目的菌同时检测的实验中，基因杂交对含有一种和两种致病菌的菌液能有效检出，但对于含有3种混合菌的菌液则较难检测。奶牛乳房炎是由多种致病菌感染引起的疾病，实际中往往是一种致病菌起主导作用，3种细菌混合感染且同时在疾病中占主导地位的几率很小，因此我们建立的针对奶牛乳房炎主要致病菌的基因杂交检测方法符合检测要求，具有实用价值。