替米考星为半人工合成的新型动物专用广谱抗生素。其具有左旋和右
旋
两种异构体，比例为85∶15，具有较广的抗菌活性和较小的MIC，对许多革兰氏阳性菌和部
分革兰氏阴性菌、支原体、螺旋体等有抑制作用，尤其对胸膜肺炎放线杆菌
、溶血性巴氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和支原体具有较强的抗菌活性。在我国已
被允许作为治疗猪和牛的巴氏杆菌病和鸡的支原体感染。替米考星预混剂由于使用方便，已
广泛应用于临床治疗。〖JP2〗但如果使用不当，会造成药物残留。为了对其在肉鸡体内的
残留消除
进行了解，以便更好地使用该药防治动物疾病，同时为制定对人类安全的休药期提供可靠的
依据，特进行了本次试验。?
1 材料与方法 ?
1.1 实验动物及投药 供试鸡为AA肉鸡，由中国农业科学院畜牧研究所提供，35日龄，体
重在2.5～3 kg之间，笼养，自由饮水、采食。供试鸡50只，连续饲喂添加150 g/t替米考星
含量的全价饲料5天，然后
改喂不含药物的饲料。同时分出10只对照鸡，饲喂不含替米考星的全价饲料。分别在停药的
0、1、3、5、7、9、11、15天处死实验鸡，每点处死5只鸡作为平行，摘取肝脏、肌肉和肾
脏冷冻保存备用。?
1.2 预混剂和饲料的配制 替米考星原料药由山东济星制药厂提供，首先将其制成20%预混
剂，然后再用20%预混剂按上述剂量添加到全价料并混匀。?
1.3 主要试剂和溶液 (1)替米考星标准品?90.7%?，由美国礼来公司提供。(2)
替米考星标
贮备液(1 mg/ml)，准确称量50 mg替米考星标准品，置50 ml棕色容量瓶中，用乙腈溶解并
定
容，密封，置4℃冰箱中保存。(3)替米考星标准溶液（250 μg/ml,50 μg/ml），按不同浓
度精确量取相应量的贮备液置10 ml容量瓶，用乙腈定容。(4)二丁胺磷酸缓冲液，将10%磷
酸溶液140 ml边加边搅拌，加到33.6 ml二正丁胺中，待溶液冷却后，用85%磷酸调pH至2.5
，再加双蒸水定容至200 ml。(5)5%氨水溶液，10%(V/V)
磷酸500 ml。(6)磷酸二氢钾缓冲液(pH ?2.5±?0.1)。(7)洗脱液（0.1M乙酸胺?甲醇?乙腈溶液）。(8)流动相，130 ml乙腈，55 ml四氢呋喃，?25 ml?二丁胺磷酸缓冲液，均须脱气
，加到700 ml已脱气的双蒸水中，再用已
脱气的双蒸水定容至1 000 ml。然后用0.2 μm的有机溶剂微孔过滤膜抽滤，封好保存备用
。?
1.4 仪器设备 高效液相色谱仪，Waters 2695；检测器，Waters 2996；二极管阵列检测
器（PDA）；微量移液器(0～20 μl,10～200 μl,20～1 000 μl,芬兰)；C18SPE柱，Bond
E
lut,6cc/500 mg；组织匀浆机，Nissei AM?6 日本AC公司；微量分析天平，BP2100 赛多；
pH计，HJ90B 北京航空宇宙计算机公司；微孔滤膜过滤器，天津腾达过滤器件厂。?
1.5 色谱条件 色谱柱：C??18?ODS（C??18?，250×4.6 mm,5 μm）Inertsil;检测
器：Waters2996PDA；检测波长：290 nm；流动相：见前述；流速： 1.1 ml/min。?
1.6 标准曲线 取一定量的替米考星贮备液于容量瓶中，用流动相稀释定容，配制成0.
05、0.5、1、5、10 μg/ml的标准溶液，分别取100 μl进样，以浓度为横坐标，峰面积为
纵坐标绘制标准曲线。?
1.7 样品处理?
1.7.1组织样品制备 将实验鸡肝脏、肌肉和肾脏用剪刀剪碎，于15 000 r/min下匀浆3 m
in。-20℃保存备用。?
1.7.2 提取 准确称量2.0 g已融化的鸡组织，置于50 ml聚丙烯离心管中，加入5
ml乙腈
，涡动混合均匀，振荡30 min，3 000 r/min离心?10 min?，移上清液于50 ml聚丙烯离心
管中
，再向盛有组织的离心管中加入2 ml 0.1 mol的磷酸二氢钾缓冲液（pH?2.5?）和5 ml乙
腈，
用玻璃棒搅拌组织块使之松散，涡动混匀，中速振荡30 min，3 000 r/min离心?10 min?
，取上
清液，合并两次的上清液于50 ml聚丙烯离心管中，加入30 ml双蒸水，混匀，过SPE净化柱
。?
1.7.3 SPE柱净化 用?10 ml?甲醇过柱，然后用?10 ml?双蒸水平衡SPE柱，让溶液
不要流干
，再把上述提取液过柱，流速不能太快，以1滴/s为宜，接着用?10 ml? 5%氨水洗涤SPE柱
，然
后用?10 ml双?蒸水洗去氨水，最后用纯乙腈洗涤，再将SPE柱吹干，或让其干燥5 min，
最后
用2.5 ml洗脱液洗脱，收集洗脱液于5 ml刻度试管中，用氮气吹干。再用流动相复溶并定容
至1.0 ml。涡动混匀，静置15 min，用?0.2 μm?针筒式滤膜过滤，每次取100μl进样分
析。?
1.8 检测限和定量限 取空白的鸡肝脏、肾脏和肌肉组织，5个平行，分别按上述样品处理
方法处理。测得基线噪
音值，按信噪比S/N=3为检测限，S/N=6为定量限。求得鸡肌肉、肝脏和肾脏组织中替米考星
的定量限和检测限。?
1.9 回收率和精密度 分别取空白的肌肉、肝脏和肾脏组织，按低、中、高3个浓度（0.0
5、0.5 μg/ml和5 μg/ml）制成添加样品，其最低浓度为定量限，按上述样品处理方法
分别
处理，分别取样100 μl进HPLC测定，计算回收率;每个浓度重复进样5次,计算变异系数。?
1.10 样品浓度计算鸡肝脏、肌肉、肾脏组织中替米考星浓度按下列公式计算：?样品浓度(μg/g)=〖SX(〗?S?S×V×F〖〗S?X×M??
?S?S?：替米考星的峰面积（顺式和反式异构体的峰面积之和）；?S?X?：标准品的峰
面积（顺式和反式异构体的峰面积之和）；?V?：提取样品最终定容的体积（ml）；?M?
：样品的质量（g）；?F?：浓缩（稀释）因子?
2 结果与讨论 ?
2.1 在浓度为0.05～10 μg/ml范围内色谱峰面积与浓度呈线性相关，其线性方程为：Y=11
2556X-3063.4，R=0.9997。若分析样品时，浓度超出此范围，则稀释样品即可。?
2.2 根据5个空白样品的基线噪音值求其平均值，按信噪比S/N=3为检测限，S/N=6为定量限
，求得鸡肌肉、肝脏和肾脏组织中替米考星的定量限和检测限分别为0.01，0.02；0.025，0
.05和0.025，?0.05 μg/g?。Carolyn M等测得鸡肾脏和肝脏的检测限和定量限分别为0.0
25 μg/g和0.06 μg/g??［5］?。与此结果基本相吻合。?
2.3 样品的低、中、高3个浓度的添加回收率和精密度见表1。从表中可知，鸡组织在0.05
、0.5、5 μg/g添加范围内，平均回收率在肌肉为75.13%～?88.07%?，肝脏为80.27%～92
.37%
，肾脏为82.7%～92.8%之间，变异系数范围在1.6%～8.8%（n=5）之间。Carolyn M.Srobba
?Wiley等的平均回收率范围在73%～98%之间，变异系数范围在0.6%～?14.7%?。可见，药
物回
收率都比较高，变异系数符合要求，该方法能够满足检测组织中替米考星残留的条件，快速
、方便，稳定可靠。
表1 替米考星的添加回收率和精密度
样品名称 添加量 (μg/g) 平均回收率(%) 变异系数(%)
肌肉 0.05 88.07 1.6
0.5 84.27 3.3
5 75.13 4.4
肝脏 0.05 83.8 5.4
0.5 92.37 3.76
5 80.27 8.4
肾脏 0.05 90.3 5.9
0.5 92.8 6.7
5 82.7 8.8
2.4 鸡各组织中替米考星平均残留量见表2。从表2可以看出，替米考星残留量以肝脏最高
，肾脏次之，肌
肉最低，说明其在肉鸡的靶器官为肝脏，此结果同张跃等报道的饮水剂的结果
类似。消
除曲线见图1，由图1可见，替米考星预混剂在肌肉消除的非常快，而在肝脏则比较缓慢。替
米考星预混剂和饮水剂在停药后各组织的残留量没有明显的区别?（P<0.5）?。替米
考星
在牛、山羊、绵羊和猪的药代学已有报道，主要药代学特征为吸收很快，消除缓慢，吸收后
迅速由血液进入组织，组织穿透力强。在奶和肺脏中浓度很高。而且表观分布容积非常大（
>2.0 L/kg）。目前还没有替米考星预混剂在肉鸡体内的药代动力学研究。本研究能够揭示
替米考
星预混剂在肉鸡体内分布和消除的一些特性。按照我国兽药残留标准??［8］?，替米考
星在肉鸡肌肉、肝脏和肾脏的最大残留量（MRL）分别为0.075、1.0 mg/kg和0.25 mg/kg。
从本研
究结果可以看出，替米考星在停药后11天在肉鸡肌肉、肝脏和肾脏中药物平均残留量分别为
?0.0346 μg/g?、0.6486 μg/g和0.1016 μg/g，低于最大残留限量，所以建议残留期为
11天。
表2 连续饲喂5天后肉鸡肌肉、肝脏和肾脏药物平均含量（n=5
停药后时间(天) 原型替米考星残留量
肝脏 肾脏 肌肉
0 15.7794 9.1016 0.7815
1 8.0065 3.0195 0.4775
3 3.8338 1.0859 0.3154
5 3.7307 0.6927 0.2847
7 1.7577 0.4287 0.1229
9 1.1592 0.2147 0.09551
11 0.6486 0.1016 0.0346
15 0.2227 0.06696 0.01987
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