山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析

摘　要：对山羊痘病毒贵州分离株(LD株和QL株)和参考株(Y株和B株)，采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后，以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA，以3种核酸内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ和PstⅠ进行酶切图谱分析。接种山羊痘病毒48 h～60h后，Vero细胞呈现典型的细胞病变；病毒基因组提取样本的纯度在1.8～1.9之间，经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带；经3种内切酶酶切后，贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致，比参考弱毒株B株少3条～4条酶切片段。这为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究奠定了基础。

关键词：山羊痘；DNA；酶切分析

山羊痘(Goat pox，GP)是由山羊痘病毒(Goat poxvirus，GPV)引起山羊和绵羊的一种高度接触性传染病，是所有动物痘病毒病中最为严重的一种，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病。近年来，我国先后有20多个省(区)报道过山羊痘的发生与流行，具有较高的发病率和病死率，这对我国特别是西部地区蓬勃发展的山羊养殖业构成了严重的威胁。

GPV是痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员之一，其基因组为大小约150 kb的线性双股DNA，包括中间编码区和两端反向末端重复序列，共含147个开放阅读框(ORF)。国内外学者对GPV的形态结构、检测技术及基因克隆表达等方面进行了较为深入的研究，取得了一定的进展，但在病毒基因组的酶切分析方面的研究资料较少。本试验通过细胞培养增殖GPV贵州分离株后，提取病毒基因组DNA并进行酶切分析，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1　毒株

GPV贵州分离株LD株和QL株，由贵州大学预防兽医学实验室分离保存；GPV参考疫苗毒株Y株，引自新疆天康畜牧生物技术公司；GPV标准弱毒株B株，购自中国兽医药品监察所。

1.2　主要试剂

限制性核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ，购自Ferments公司；蛋白酶K和标准分子质量Marker λDNA/HindⅢ，购自Amersco公司；其他化学试剂均为进口分析纯。

1.3　病毒的增殖与浓缩

取上述病毒液，加入适量双抗溶液，经过滤除菌后，接种于已长成单层的Vero细胞上，孵育1 h，加入含20mL/L犊牛血清的维持液继续培养，每隔6 h观察细胞病变。取细胞病变明显的细胞培养物反复冻融3次，于4 ℃以4 000r/min离心20 min，取上清液加入含300 g/L蔗糖溶液垫底的离心管中，于4 ℃以30 000 r/min离心60min，弃上清液，沉淀用适量TE溶液溶解，置－20 ℃保存备用。

1.4　病毒基因组DNA的提取

取适量的浓缩病毒液，加入100 mL/L SDS和蛋白酶K至终浓度相应为5 mL/L和200 μg/mL,56 ℃水浴消化1h后，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)溶液，充分混匀后，于4 ℃以12 000 r/min离心10min，取上清液重复抽提1次。加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇，－20 ℃沉淀30min，于4 ℃以12 000 r/min离心15 min，取沉淀用700 mL/L乙醇洗涤1～2次，于4 ℃以12 000r/min离心15 min，自然干燥后溶于适量TE溶液中。取适量病毒DNA样本，经适当稀释后，于紫外分光光度计测定OD260和OD280值，并于8 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。

1.5　病毒基因组酶切反应与电泳观察

取上述提取的病毒基因组DNA，分别采用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切反应，酶切体系为25 μL，即病毒基因组DNA样本6 μL、限制性内切酶1.5 μL、酶切缓冲液2.5 μL和双蒸水15μL。充分混匀并作短暂离心后，37 ℃恒温水浴作用过夜，取酶切产物10 μL，于8 g/L琼脂糖凝胶电泳(电压80 V，电泳3h)，凝胶成像分析仪观察，并采用Quantity One软件分析GPV基因组DNA的酶切片段分子质量。

2　结果

2.1　细胞病变观察

接种山羊痘病毒，经37 ℃培养48h～60h后，Vero细胞可以观察到细胞病变(CPE)，如细胞折光性增强、细胞间隙增大或细胞圆缩等；培养到72 h～96h后，细胞病变更为明显，表现为细胞集聚成簇或脱落呈空斑状等(图1)；而正常Vero细胞培养96h后仍无明显变化，呈排列紧密的梭状细胞(图2)。　

图1　病毒接种72 h后的细胞病变

Fig.1　CPE of Vero cells 72 h post-infection

图2　正常Vero细胞对照

Fig.2　Control of normal Vero cells

2.2　病毒基因组的含量与纯度

取上述提取的4株病毒基因组DNA样本，经适当稀释后，于UV2000型紫外分光光度计测定样本的OD260和OD280值(表1)。

表1　病毒基因组DNA样本的含量与纯度

Table 1　Contents and purity of genomic DNA samples of GPV

从表1可以看出，从感染的Vero细胞中提取4株病毒基因组样本，其DNA含量在3 μg/μL～4 μg/μL之间，OD260/ OD280值为1.8～2.0，即DNA样本中蛋白质、RNA及有机溶剂的污染较少。经8g/L琼脂糖凝胶电泳显示，4株病毒的DNA样本均呈现一条较为纯净的条带，而正常Vero细胞提取样本未出现特异性条带。这些结果说明，所提取的病毒DNA样本的纯度较高，可应用于酶切图谱分析。

2.3　病毒基因组的酶切结果

采用3种限制性内切酶分别对GPV LD株、QL株、Y株和B株的基因组DNA样本进行酶切消化，经8g/L琼脂糖凝胶电泳后，结果显示，4株病毒基因DNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段相应为13、13、13和15条，而PstⅠ酶切片段为11、11、11和15条。使用Quantity One软件分析，各种酶切片段分子质量见表2。

表2　GPV基因组DNA酶切结果(kb)

Table 2　The results of restriction endonuclease of GPV genomic DNA

从表2中可见，GPV LD株、QL株和Y株基因组DNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段大小相应为3.4 kb～23.8 kb和3.4 kb～21.8 kb不等，PstⅠ酶切片段大小相应为3.5 kb～21.4 kb；而B株相应为1.4 kb～23.8 kb、3.3 kb～20.3 kb和2.4kb～22.0 kb。

3　讨论

3.1　关于GPV的细胞培养

细胞培养是研究动物病毒的重要步骤之一。对于山羊痘病毒来说，常选用的原代细胞有胎羊的睾丸细胞、肾细胞和皮肤上皮细胞等。但由于原代细胞的取材困难，且不易长期传代培养，因此在山羊痘病毒的分离鉴定中较难得到广泛应用。本试验尝试采用BHK-21、Vero细胞等传代细胞进行山羊痘病毒的培养。结果发现，山羊痘病毒可以在这些传代细胞上增殖，一般需要传3代～5代后才能产生稳定的细胞病变，且Vero细胞的细胞病变较BHK21细胞明显。因此，贵州大学预防兽医学实验室在山羊痘病毒的研究中一直采用Vero细胞对该病毒的增殖培养。

3.2　关于GPV基因组的提取

获得纯净而完整的病毒基因组是进行病毒基因组酶切分析的前提。山羊痘病毒的基因组为大小约150kb的线状双链DNA，这种线状双链DNA分子在水溶液中对机械剪切力的抗性十分脆弱，很容易造成双链DNA的断裂，从而影响病毒基因组DNA的酶切效果。因此，在病毒基因组DNA的提取过程中尽量做到手法轻柔，在保证清除蛋白质等杂质的情况下尽量避免重复提取步骤，以确保病毒基因组DNA的完整性和纯度。本试验结果显示，4株病毒DNA样本的OD260/ OD280值在1.8～2.0之间，且电泳只有1个DNA条带，表明所提取的病毒基因组具有较好的完整性且纯度较高，可应用于酶切图谱分析。

3.3　关于GPV基因组的酶切图谱

本试验采用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ对山羊痘病毒基因组DNA进行酶切消化后，酶切片段分子质量的累加值在102.9 kb～121.4kb之间，与山羊痘病毒基因组的实际分子质量(约150kb)不尽一致。这些差异产生的原因可能有：①琼脂糖凝胶电泳的分辨率低而造成酶切片段定位上的误差，导致各酶切片段分子质量测定存在差异；②由于山羊痘病毒基因组较大，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳时，可能存在小分子质量DNA片段的丢失、大分子质量DNA片段的计算误差以及分子质量相近的酶切片段出现重叠等，从而导致测定的山羊痘病毒基因组长度偏低。

酶切图谱显示，山羊痘病毒贵州分离株LD株和QL株与疫苗毒株Y株基本一致，而与标准弱毒株B株存在一定的差异，如在EcoRⅠ酶切片段上较标准毒株少3.9、3.2、1.5、1.4 kb 4条片段，在HindⅢ酶切片段上少3.7 kb和3.3 kb 2条片段，在PstⅠ酶切片段上少4.6、2.8、2.5、2.4 kb4条片段。表明山羊痘病毒地方流行毒株在DNA分子结构上已发生了某些细微的变化，如碱基突变等。这些酶切图谱的差异是否与山羊痘病毒的毒力存在一定的相关性，有待进一步研究。

摘　要：对山羊痘病毒贵州分离株(LD株和QL株)和参考株(Y株和B株)，采用Vero细胞增殖和差速离心浓缩后，以SDS-蛋白酶K法提取病毒基因组DNA，以3种核酸内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ和PstⅠ进行酶切图谱分析。接种山羊痘病毒48 h～60h后，Vero细胞呈现典型的细胞病变；病毒基因组提取样本的纯度在1.8～1.9之间，经琼脂糖凝胶电泳均出现一条纯净的DNA条带；经3种内切酶酶切后，贵州分离株的酶切图谱与参考疫苗毒株Y株基本一致，比参考弱毒株B株少3条～4条酶切片段。这为山羊痘病毒毒力基因的进一步研究奠定了基础。

关键词：山羊痘；DNA；酶切分析

山羊痘(Goat pox，GP)是由山羊痘病毒(Goat poxvirus，GPV)引起山羊和绵羊的一种高度接触性传染病，是所有动物痘病毒病中最为严重的一种，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病。近年来，我国先后有20多个省(区)报道过山羊痘的发生与流行，具有较高的发病率和病死率，这对我国特别是西部地区蓬勃发展的山羊养殖业构成了严重的威胁。

GPV是痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员之一，其基因组为大小约150 kb的线性双股DNA，包括中间编码区和两端反向末端重复序列，共含147个开放阅读框(ORF)。国内外学者对GPV的形态结构、检测技术及基因克隆表达等方面进行了较为深入的研究，取得了一定的进展，但在病毒基因组的酶切分析方面的研究资料较少。本试验通过细胞培养增殖GPV贵州分离株后，提取病毒基因组DNA并进行酶切分析，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1　毒株

GPV贵州分离株LD株和QL株，由贵州大学预防兽医学实验室分离保存；GPV参考疫苗毒株Y株，引自新疆天康畜牧生物技术公司；GPV标准弱毒株B株，购自中国兽医药品监察所。

1.2　主要试剂

限制性核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ，购自Ferments公司；蛋白酶K和标准分子质量Marker λDNA/HindⅢ，购自Amersco公司；其他化学试剂均为进口分析纯。

1.3　病毒的增殖与浓缩

取上述病毒液，加入适量双抗溶液，经过滤除菌后，接种于已长成单层的Vero细胞上，孵育1 h，加入含20mL/L犊牛血清的维持液继续培养，每隔6 h观察细胞病变。取细胞病变明显的细胞培养物反复冻融3次，于4 ℃以4 000r/min离心20 min，取上清液加入含300 g/L蔗糖溶液垫底的离心管中，于4 ℃以30 000 r/min离心60min，弃上清液，沉淀用适量TE溶液溶解，置－20 ℃保存备用。

1.4　病毒基因组DNA的提取

取适量的浓缩病毒液，加入100 mL/L SDS和蛋白酶K至终浓度相应为5 mL/L和200 μg/mL,56 ℃水浴消化1h后，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)溶液，充分混匀后，于4 ℃以12 000 r/min离心10min，取上清液重复抽提1次。加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇，－20 ℃沉淀30min，于4 ℃以12 000 r/min离心15 min，取沉淀用700 mL/L乙醇洗涤1～2次，于4 ℃以12 000r/min离心15 min，自然干燥后溶于适量TE溶液中。取适量病毒DNA样本，经适当稀释后，于紫外分光光度计测定OD260和OD280值，并于8 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。

1.5　病毒基因组酶切反应与电泳观察

取上述提取的病毒基因组DNA，分别采用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ进行酶切反应，酶切体系为25 μL，即病毒基因组DNA样本6 μL、限制性内切酶1.5 μL、酶切缓冲液2.5 μL和双蒸水15μL。充分混匀并作短暂离心后，37 ℃恒温水浴作用过夜，取酶切产物10 μL，于8 g/L琼脂糖凝胶电泳(电压80 V，电泳3h)，凝胶成像分析仪观察，并采用Quantity One软件分析GPV基因组DNA的酶切片段分子质量。

2　结果

2.1　细胞病变观察

接种山羊痘病毒，经37 ℃培养48h～60h后，Vero细胞可以观察到细胞病变(CPE)，如细胞折光性增强、细胞间隙增大或细胞圆缩等；培养到72 h～96h后，细胞病变更为明显，表现为细胞集聚成簇或脱落呈空斑状等(图1)；而正常Vero细胞培养96h后仍无明显变化，呈排列紧密的梭状细胞(图2)。　

图1　病毒接种72 h后的细胞病变

Fig.1　CPE of Vero cells 72 h post-infection

图2　正常Vero细胞对照

Fig.2　Control of normal Vero cells

2.2　病毒基因组的含量与纯度

取上述提取的4株病毒基因组DNA样本，经适当稀释后，于UV2000型紫外分光光度计测定样本的OD260和OD280值(表1)。

表1　病毒基因组DNA样本的含量与纯度

Table 1　Contents and purity of genomic DNA samples of GPV

从表1可以看出，从感染的Vero细胞中提取4株病毒基因组样本，其DNA含量在3 μg/μL～4 μg/μL之间，OD260/ OD280值为1.8～2.0，即DNA样本中蛋白质、RNA及有机溶剂的污染较少。经8g/L琼脂糖凝胶电泳显示，4株病毒的DNA样本均呈现一条较为纯净的条带，而正常Vero细胞提取样本未出现特异性条带。这些结果说明，所提取的病毒DNA样本的纯度较高，可应用于酶切图谱分析。

2.3　病毒基因组的酶切结果

采用3种限制性内切酶分别对GPV LD株、QL株、Y株和B株的基因组DNA样本进行酶切消化，经8g/L琼脂糖凝胶电泳后，结果显示，4株病毒基因DNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段相应为13、13、13和15条，而PstⅠ酶切片段为11、11、11和15条。使用Quantity One软件分析，各种酶切片段分子质量见表2。

表2　GPV基因组DNA酶切结果(kb)

Table 2　The results of restriction endonuclease of GPV genomic DNA

从表2中可见，GPV LD株、QL株和Y株基因组DNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段大小相应为3.4 kb～23.8 kb和3.4 kb～21.8 kb不等，PstⅠ酶切片段大小相应为3.5 kb～21.4 kb；而B株相应为1.4 kb～23.8 kb、3.3 kb～20.3 kb和2.4kb～22.0 kb。

3　讨论

3.1　关于GPV的细胞培养

细胞培养是研究动物病毒的重要步骤之一。对于山羊痘病毒来说，常选用的原代细胞有胎羊的睾丸细胞、肾细胞和皮肤上皮细胞等。但由于原代细胞的取材困难，且不易长期传代培养，因此在山羊痘病毒的分离鉴定中较难得到广泛应用。本试验尝试采用BHK-21、Vero细胞等传代细胞进行山羊痘病毒的培养。结果发现，山羊痘病毒可以在这些传代细胞上增殖，一般需要传3代～5代后才能产生稳定的细胞病变，且Vero细胞的细胞病变较BHK21细胞明显。因此，贵州大学预防兽医学实验室在山羊痘病毒的研究中一直采用Vero细胞对该病毒的增殖培养。

3.2　关于GPV基因组的提取

获得纯净而完整的病毒基因组是进行病毒基因组酶切分析的前提。山羊痘病毒的基因组为大小约150kb的线状双链DNA，这种线状双链DNA分子在水溶液中对机械剪切力的抗性十分脆弱，很容易造成双链DNA的断裂，从而影响病毒基因组DNA的酶切效果。因此，在病毒基因组DNA的提取过程中尽量做到手法轻柔，在保证清除蛋白质等杂质的情况下尽量避免重复提取步骤，以确保病毒基因组DNA的完整性和纯度。本试验结果显示，4株病毒DNA样本的OD260/ OD280值在1.8～2.0之间，且电泳只有1个DNA条带，表明所提取的病毒基因组具有较好的完整性且纯度较高，可应用于酶切图谱分析。

3.3　关于GPV基因组的酶切图谱

本试验采用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ和PstⅠ对山羊痘病毒基因组DNA进行酶切消化后，酶切片段分子质量的累加值在102.9 kb～121.4kb之间，与山羊痘病毒基因组的实际分子质量(约150kb)不尽一致。这些差异产生的原因可能有：①琼脂糖凝胶电泳的分辨率低而造成酶切片段定位上的误差，导致各酶切片段分子质量测定存在差异；②由于山羊痘病毒基因组较大，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳时，可能存在小分子质量DNA片段的丢失、大分子质量DNA片段的计算误差以及分子质量相近的酶切片段出现重叠等，从而导致测定的山羊痘病毒基因组长度偏低。

酶切图谱显示，山羊痘病毒贵州分离株LD株和QL株与疫苗毒株Y株基本一致，而与标准弱毒株B株存在一定的差异，如在EcoRⅠ酶切片段上较标准毒株少3.9、3.2、1.5、1.4 kb 4条片段，在HindⅢ酶切片段上少3.7 kb和3.3 kb 2条片段，在PstⅠ酶切片段上少4.6、2.8、2.5、2.4 kb4条片段。表明山羊痘病毒地方流行毒株在DNA分子结构上已发生了某些细微的变化，如碱基突变等。这些酶切图谱的差异是否与山羊痘病毒的毒力存在一定的相关性，有待进一步研究。