应用复合中草药提取物对IBD中等毒力活疫苗免疫增强作用的研究

摘　要：选用两种在山东省普遍使用的中等毒力IBD活疫苗，将240只试验用商品鸡随机分成12组，分别在12日龄和19日龄两次免疫，同时在11日龄时用复合中草药提取物饮水，连用7d，二免后13 d人工接种vvIBDV，连续观察14d。结果表明，无论从抗体水平、囊指数、BBIX值、B淋巴细胞EAC花环形成率、T淋巴细胞α-醋酸萘酯酶素(ANAE)阳性率、红细胞(RBC)免疫黏附功能，还是从病理组织学检查、临床保护率、病理保护率等指标来看，都充分表明该复合中草药提取物对中等毒力IBD活疫苗具有显著的免疫增强作用，而且对提高法氏囊等免疫器官的保护作用及疫苗对其损伤后的修复作用也有显著效果。

关键词：复合中草药提取物；中等毒力IBD活疫苗；IBDV超强毒；保护率

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursal diseasevirus，IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病常发生于3周龄～12周龄雏鸡与青年鸡，主要破坏鸡的中枢免疫器官――法氏囊，使法氏囊中的B淋巴细胞分化增殖受阻，造成机体的免疫抑制，导致感染鸡对其他致病因子的感染性增加和对其他疫苗的免疫应答能力下降，对养禽业造成严重的危害。1987年一种以高发病率和高病死率为特征的IBDV超强毒(veryvirulent infectious bursal disease virus，vvIBDV)或高致病力IBDV(highlyvirulent infectious bursal diseasevirus，hvIBDV)陆续在荷兰、英国、比利时、德国、日本等国家报道，辛桂香等报道我国也存在着这种vvIBDV。目前，多数学者认为vvIBDV是引起鸡IBD免疫失败的主要因素。

中等毒力IBD疫苗虽能在一定程度上突破母源抗体的干扰，减少vvIBDV所导致的临床死亡，但由于其本身对家禽免疫器官有一定程度的损伤，从而影响机体的免疫功能，再加上环境中各种致病因子尤其是免疫抑制性致病因子和应激因素等的相互作用，使得该病的防控更加困难。

为了克服以上这些弊端，提高免疫效果，国内外许多学者普遍开展了对免疫增强剂的研究，而且涉及范围也较广。免疫增强剂的种类很多，如卡介苗、植物血凝素等生物制剂，左旋咪唑等化学合成类物质，维生素E、微量元素硒等营养类物质，这些物质虽然具有一定的免疫增强作用，但其毒副作用及药物残留也不容忽视。目前，中草药的免疫增强作用成为研究的热点，但多是一些散剂或单一中草药的提取物，并不适合家禽各种体质和当前群体给药的特点，为此，我们从益气、补血、滋阴、壮阳等四个方面用正交试验法优选了一种复合中草药提取物，为了进一步验证其在IBD疫苗免疫上的应用效果，进行了本项试验。

1　材料与方法

1.1　IBD疫苗

在山东省较为普遍使用的两种中等毒力疫苗，均为国产，甲种疫苗为NF8株，乙种疫苗为BJ836株，按照疫苗使用说明书分别点眼进行免疫。

1.2　试验用鸡

商品海兰白蛋鸡，10日龄时，AGP检测母源抗体阳性率小于50%。

1.3　复合中草药提取物

中国农业大学动物医学院兽药研究所制备，主要成分为黄芪多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖和当归多糖，饮水浓度为1 g/L，连用7 d。

1.4　超强毒株

vvIBDV SD-1/97株，其ELD50为10－3.50.1 mL，每只鸡接种病毒液(30倍稀释)0.2 mL，点眼、滴鼻各0.1 mL。

1.5　分组及处理

将11日龄海兰白蛋鸡随机分成12组，分别隔离饲养，饲养管理完全相同。

1组为空白对照组，不做任何处理，共10只鸡。

2组为攻强毒对照组，饲养至32日龄时攻强毒，共30只鸡。

3组为疫苗对照组，12日龄时首免，19日龄时二免甲种疫苗，共10只鸡。

4组为疫苗对照组，12日龄时首免，19日龄时二免乙种疫苗，共10只鸡。

5组为疫苗免疫攻强毒对照组，12日龄时首免，19日龄时二免甲种疫苗，32日龄时攻强毒，共30只鸡。

6组为疫苗免疫攻强毒对照组，12日龄时首免，19日龄时二免乙种疫苗，32日龄时攻强毒，共30只鸡。

7组为增强剂对照组，在19日龄时，用增强剂饮水，连用10 d，共10只鸡。

8组为增强剂攻强毒对照组，在19日龄时，用增强剂饮水，连用10 d，在32日龄时攻强毒，共30只鸡。

9组为免疫增强剂对照组，12日龄时首免，19日龄时二免甲种疫苗，在11日龄时用增强剂饮水，至第21日龄时结束即连用10d，共10只鸡。

10组为免疫增强剂对照组，12日龄时首免，19日龄时二免乙种疫苗，在11日龄时用增强剂饮水，至第21日龄时结束即连用10d，共10只鸡。

11组为试验组，12日龄时首免，19日龄时二免甲种疫苗，在11日龄时用增强剂饮水，至第21日龄时结束即连用10d,32日龄时攻强毒，共30只鸡。

12组为试验组，12日龄时首免，19日龄时二免乙种疫苗，在11日龄时用增强剂饮水，至第21日龄时结束即连用10d,32日龄时攻强毒，共30只鸡。

1.6　发病情况、病理及免疫学检测

病理剖检，测其囊指数即法氏囊重(mg)/体重(g)，用常规AGP方法检测IBD抗体，取法氏囊、胸腺、脾脏等，常规方法制备石腊切片，苏木素-伊红染色，显微镜下观察。做B淋巴细胞EAC花环试验，测定EAC花环形成率(%)，并做T淋巴细胞ANAE阳性率试验，检测ANAE阳性率(%)。按文献做红细胞C3bR花环试验和免疫复合物(IC)花环试验，测定C3bR和IC花环形成率(%)。计算各疫苗保护率。

2　结果

2.1　发病情况及病理剖检

空白对照组在整个试验过程中没有异常变化，病理剖检基本正常。

攻强毒对照组在攻毒后第2天，出现临床症状，发病率100%，第3天开始死亡，截止到第14天时共死亡25只，死亡率为83.3%，耐过鸡消瘦，生长缓慢。剖检死亡鸡可见典型IBD病理变化特征。

疫苗对照两组在整个试验过程中有轻微临床症状，第22日龄时分别剖检2只，可见法氏囊稍水肿，偶见出血点，脾脏、胸腺偶见出血点。第32日龄时已基本恢复正常。

疫苗免疫攻毒对照两组在整个试验过程中无一死亡，其中第5组有2只、第6组有3只出现IBD特征性临床症状。剖检可见第5组有3只、第6组有4只出现IBD特征性病变。

增强剂对照组在整个试验过程中，鸡群精神状态良好，羽毛整齐，光泽度高，身体健壮，剖检无肉眼可见病理变化。

增强剂攻毒对照组在攻毒后第4天开始发病，发病率100%，截止到第14天时，死亡率为63.3%，有11只鸡耐过。剖检病死鸡可见典型IBD病变。

免疫增强剂对照两组在整个试验过程中没有明显变化，剖检未发现肉眼可见病理变化。

试验两组在整个试验过程中没有异常情况，剖检中发现第12组有1只鸡出现轻微法氏囊病理变化。

2.2　病理组织学检查

空白对照组无异常组织学变化。

攻强毒对照组死亡鸡法氏囊病变较重，淋巴细胞大量变性、坏死，网状细胞增生，炎性细胞浸润(图1)。

图1　疫苗免疫攻强毒对照组的法氏囊病理切片

Fig.1　The bursal pathological section of the vaccine immunizedcontrol group challenged with the vvIBDV

疫苗对照组可见法氏囊滤泡皮质、髓质分界不明显，淋巴细胞少而小，有的淋巴细胞崩解、死亡，淋巴滤泡间质增宽，部分滤泡萎缩。二免后第13天，即第32日龄时已基本恢复正常。

疫苗免疫攻强毒对照组可见部分法氏囊淋巴小结渐进性坏死，炎症细胞浸润，有的见残核碎屑。

增强剂对照组可见法氏囊黏膜皱壁较大且明显，淋巴滤泡大而密集，皮质与髓质分界明显。脾小体较多，脾索淋巴细胞密集，脾中央动脉周围淋巴组织鞘丰富且细胞密集。胸腺小叶大，皮质较厚(图2)。

增强剂攻强毒对照组法氏囊淋巴细胞小而少，皮质与髓质分界不明显，淋巴细胞崩解、死亡。脾脏白髓较少、网状细胞增生，红髓脾索淋巴细胞减少。胸腺淋巴细胞减少，网状细胞增生。

免疫增强剂对照组可见法氏囊皱壁较大且明显，滤泡发育良好，脾小体较多，脾索淋巴细胞密集，胸腺发育良好(图3)。

试验组镜检可见法氏囊组织结构发育良好，皮质、髓质淋巴细胞排列比较紧密，其他没有发现异常病理变化。　

图2　使用免疫增强剂的试验第11组的法氏囊病理切片

Fig.2　The bursal pathological section of 11th group　usedimmunostimulants

图3　使用免疫增强剂的试验第12组的法氏囊病理切片

Fig.3　Thebursal pathological section of 12th group\"s usedimmunostimulants

2.3　抗体检测结果

2.3.1　疫苗免疫后抗体阳性率　试验鸡在试验前用AGP法抽检抗体，结果分析差异不显著。分别于表1所示时间随机抽取3只雏鸡的血清(由翅静脉采血)，用AGP法检测，可见首免后第7天，对照3、4两组抗体阳性率不足10%，在二免后第10天才90%左右，而使用免疫增强剂的对照9、10两组在首免后第7天就达到了17.2%和15.8%，二免后第10天抗体阳性率就已全部达到100%，两者差异显著(P<0.05)，对照3、4两组在二免后13d才接近这一水平。可见，使用免疫增强剂后，抗体阳性率明显提高，抗体产生的时间也明显提前。

表1　不同疫苗免疫后抗体阳性率

Table 1　The results of antibody positive rate after immunization%

2.3.2　IBD疫苗免疫后AGP抗体几何均值　由表2可以看出，免疫后第10天，使用免疫增强剂的9、10两组分别比3、4两组高出1.3和1.0个滴度，在免疫后13d，分别高出了1.7和1.6个滴度，两者差异显著(P<0.05)。可见，使用免疫增强剂后，抗体滴度明显提高。

表2　二免后AGP抗体几何均值(GMT)

Table 2　The difference of AGP antibody titres in each group aftersecond immunization

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2.4　二免后对法氏囊的影响

由表3可以看出，二免后第13天，对照3、4两组囊指数分别是2.16和2.02，与空白对照组差异显著(P<0.05)，而使用免疫增强剂的9、10两组与空白对照组差异不显著(P>0.05)。而对照7组囊指数却达到了4.07，比空白对照组高出了0.41。根据文献记载，若BBIX<0.7，则判法氏囊为萎缩，如果按照这个标准，对照3、4两组法氏囊处于萎缩状态，而9、10两组则已基本正常。另外，只使用免疫增强剂的对照7组，其BBIX值达到1.11，比空白对照组还高出0.11。说明我们所用复合中草药提取物具有免疫增强作用。

表3　二免后第13天对法氏囊的影响结果

Table 3　The result of the ratios of chicken bursal of fabricious tobody weight after second immunization

注：BBIX：试验组囊指数/空白对照组囊指数。

Note：Bursal index in the experimental group/bursal index in theblank control group.

2.5　复合中草药提取物对雏鸡B淋巴细胞EAC花环率的影响

复合中草药提取物对雏鸡B淋巴细胞EAC花环形成率的影响结果见表4。经统计分析，使用增强剂的第7组B淋巴细胞EAC花环形成率极显著高于空白对照组(P<0.01)，说明该复合中药提取物具有促进体液免疫功能的作用。使用增强剂的9、10两组与未使用增强剂的3、4两组相比，两者差异极显著(P<0.01)，提示该复合中药提取物对雏鸡接种IBD疫苗产生的特异性免疫具有显著的促进和增强作用。

表4　复合中草药提取物对雏鸡B淋巴细胞EAC花环率的影响

Table 4　The influence of compound Chinese medicine extraction to Blymphocyte EAC rosette rate %

2.6　复合中草药提取物对雏鸡T淋巴细胞ANAE花环率的影响

复合中草药提取物对雏鸡T淋巴细胞ANAE花环形成率的影响结果见表5。经统计分析，使用增强剂的第7组T淋巴细胞ANAE花环形成率极显著高于空白对照组(P<0.01)，说明该复合中药提取物具有促进细胞免疫功能的作用。使用增强剂的9、10两组与未使用增强剂的3、4两组相比，两者差异极显著(P<0.01)，提示该复合中药提取物对雏鸡接种IBD疫苗产生的细胞免疫具有显著的促进和增强作用。

表5　复合中草药提取物对雏鸡T淋巴细胞ANAE花环率的影响

Table 5　The influence of compound Chinese medicine extraction to Blymphocyte ANAE rosette rate %

2.7　复合中草药提取物对雏鸡RBC免疫功能的影响

复合中草药提取物对雏鸡RBC免疫功能的影响结果见表6。经统计分析，未使用增强剂的3、4两组其C3bR花环率小于空白对照组，两者差异不显著(P>0.05)，增强剂对照7组极显著高于空白对照组(P<0.01)，而使用增强剂的9、10两组与空白对照组相比，其C3bR花环率显著高于空白对照组(P<0.05)，极显著高于3、4两组(P<0.01)，说明该中草药提取物具有一定的提高红细胞C3bR花环率的作用。

未使用增强剂的3、4两组其IC花环率25日龄时显著小于空白对照组(P<0.05),32日龄时两者差异不显著(P>0.05)。增强剂对照7组高于空白对照组，但两者差异不显著(P>0.05)。而使用增强剂的9、10两组在25日龄时显著高于空白对照组(P<0.05)，极显著高于未使用增强剂的3、4两组(P<0.01)，在32日龄时略高于空白对照组，但两者差异不显著(P>0.05)，也高于3、4两组，但两者差异不显著(P>0.05)。说明该中草药提取物具有一定的提高红细胞IC花环率的作用。

表6　复合中草药提取物对雏鸡RBC免疫功能的影响

Table 6　Theinfluence of compound Chinese medicine extraction to RBCimmunologic function%

2.8　两种IBD疫苗的免疫效力测定

表7中临床保护率表示临床上无任何IBD症状者，判为100%临床保护。病理保护率表示法氏囊，胸腺和脾脏等免疫器官无典型IBD剖检病变和其他肉眼可见病理变化者，判为100%病理保护。

攻毒后14 d，剖检部分鸡只结果如表7所示，试验结束时对照5、6两组，其囊指数分别是2.98和2.65，与空白对照组差异极显著(P<0.01)，BBIX值均小于0.7，法氏囊仍处于萎缩状态，虽然其临床保护率在90%左右，但其病理保护率却很不理想，而使用免疫增强剂的试验11、12两组在试验结束时，其囊指数分别是3.87和3.49，与空白对照组差异不显著(P>0.05)，BBIX值大于0.7，说明法氏囊已恢复正常，无论临床保护率还是病理保护率都达到100%，显著优于对照5、6两组，二者差异极显著(P<0.01)。

表7　两种IBD疫苗的免疫效力测定结果

Table 7　The result of the immunity of two IBD vaccines in chickens

3　讨论

用SD-1/97毒株接种32日龄商品鸡后，第2天开始发病，病死率为83.3%。剖检可见典型的IBD病变，如法氏囊显著肿大，呈“紫葡萄”样等，与英国、荷兰等国家的学者和我国学者辛桂香等所报道的vvIBDV感染情况基本一致，从而也进一步证明本试验所用毒株确为超强毒株。

用常规AGP方法检测IBD抗体，结果表明，使用免疫增强剂的对照9、10两组在二免后第10天抗体已全部阳性且抗体水平较高，而对照3、4两组在二免后第13天才接近全部阳性且抗体水平也不是很高，两者差异显著(P<0.05)，可见，使用免疫增强剂后，抗体产生的时间不仅早，而且水平也高，表明免疫增强剂能够促进法氏囊的生长发育，增强机体的免疫功能，加快抗体的生成。

法氏囊是家禽的中枢免疫器官，是B细胞分化成熟的场所。法氏囊指数是法氏囊生长发育程度的一个重要指标，它代表着机体免疫状态的水平。从试验结果看，二免后第13天，使用免疫增强剂的9、10两组其囊指数与对照3、4两组相比差异显著(P<0.05)，增强剂对照7组的囊指数为4.07，比正常空白对照组高出0.41。对照3、4两组BBIX值均小于0.7，法氏囊处于萎缩状态，而9、10两组法氏囊已恢复正常。此外也可看出，各组间BBIX值的大小与它们相对应组间的抗体水平有一定的对应关系，即抗体水平较高者，其BBIX值也较大。上述结果都表明了复合中草药提取物不仅能促进法氏囊等免疫器官的发育，提高机体的免疫功能，而且对于IBD中等毒力疫苗所造成的法氏囊损伤有很强的修复作用，并且对这种损伤后的恢复再生也有明显地促进作用。

在家禽体内的免疫活性细胞中，T淋巴细胞、B淋巴细胞的数量与机体免疫功能的高低有着非常密切的关系，两者数量的增加反映了机体免疫力的提高，因此，T、B淋巴细胞的多少是机体全身免疫机能强弱的一个具体表现。T淋巴细胞ANAE花环率显著升高，可增强细胞免疫功能，它除能产生更多的淋巴因子提高机体免疫力外，还具有辅助体液免疫的意义。B淋巴细胞EAC花环率的提高，可增强体液免疫功能，使抗体水平提高，充分说明该复合中草药提取物能明显提高家禽机体T、B淋巴细胞的数量，同时也可以看出，T淋巴细胞ANAE花环率与IBD的抗体效价有相应的消涨趋势。

本试验结果表明，该中草药免疫增强剂配合IBD疫苗使用，可以明显提高家禽红细胞的免疫功能，对C3bR花环率的提高的效果要好于对IC花环率的影响，在25日龄即二免后第6天影响更为显著，32日龄即二免后第13天时差别不大。通过本试验还发现，使用IBD疫苗免疫后，可引起家禽C3bR花环率和IC花环率明显降低，在32日龄时，降低幅度减小，与空白对照组差异不显著(P>0.05)，说明IBD疫苗免疫后会引起机体红细胞免疫功能短暂性下降。可见，该复合中草药提取物能够明显增强机体红细胞C3bR花环率和IC花环率，并可激发机体在免疫后很快产生较高浓度的抗体。同时，还能够消除IBD疫苗引起的红细胞免疫功能降低，提高疫苗的免疫效果。

自从Siegel提出了“红细胞免疫系统(RCIS)”概念以来，国内外学者对多种动物RBC免疫功能进行了测试，并将其作为反映机体免疫机能状态的指标之一。近年的一些研究表明，RBC可借助膜上的C3bR介导的RBC免疫黏附反应发挥各种免疫机能，即识别和携带Ag清除血液中免疫复合物(IC)，促进B淋巴细胞的转化率并促进IgG、IgA生成；增强T细胞依赖性反应，促进T细胞产生干扰素，增强NK细胞毒性作用，促进LAK细胞对肿瘤的杀伤力。本试验利用红细胞C3bR花环试验和IC花环试验，检测了雏鸡RBC免疫功能，证实了雏鸡RCIS的存在，并证明该复合中草药提取物有显著的促进雏鸡RBC免疫功能的作用。

病理组织学结果表明，使用免疫增强剂后，法氏囊皱壁大且明显，淋巴滤泡大且密集，脾索淋巴细胞密集，脾中央动脉周围淋巴组织鞘厚且细胞密集，胸腺小叶大，皮质较厚等，而未使用免疫增强剂的，则不同程度的出现法氏囊的滤泡皮、髓质分界不明显，滤泡萎缩，淋巴细胞坏死或减少，网状细胞增生等，由此可以看出，复合中草药提取物可以促进机体免疫器官(如法氏囊、胸腺、脾脏)的生长发育，对抗vvIBDV和IBD疫苗对免疫器官的损伤，促进受损器官的修复，使免疫器官的组织结构保持或恢复至正常水平。

免疫效力测定结果表明，使用免疫增强剂的试验11、12两组，其囊指数与对照5、6两组相比差异显著(P<0.05)，BBIX值均大于0.7，说明法氏囊已恢复正常，而其对照组则处于萎缩状态。此外，没有使用免疫增强剂的对照5、6两组，虽然其临床保护率较好，但其病理保护率却很不理想，而使用免疫增强剂的试验11、12两组不仅临床保护率100%，病理保护率也达到了100%和96.7%，与对照组相比差异显著(P<0.05)，充分说明了复合中草药提取物具有增强机体免疫功能，进而提高IBD疫苗免疫效力的作用。

综上所述，可见该复合中草药提取物不仅能够促进法氏囊等免疫器官的生长发育，激活机体的体液免疫和细胞免疫系统，增强机体的免疫功能，显著提高IBD疫苗的免疫效果，而且对于IBD中等毒力疫苗所造成的法氏囊等免疫器官的病理性损伤有很强的修复作用，并且对这种损伤后的恢复再生也有明显地促进作用。