穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe致大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌NO及ET-1的影响

志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）是猪水肿病（ED）的主要致病因子。目前的研究显示：SLT-Ⅱe致病机制是通过对其靶细胞-――肠黏膜微血管内皮细胞的刺激，引发细胞分泌机能的改变，释放各种细胞因子影响细胞的正常形态和功能。NO与ET-1是由血管内皮细胞分泌的一对作用相反的因子，分别有舒张和收缩血管的作用。血管内皮细胞通过调控NO与ET-1的释放平衡来调节血管的功能。

穿心莲内酯为爵床科植物穿心莲的有效成分。现代药理学研究表明，穿心莲内酯具有调节血管舒缩、抗血栓及血小板聚集等多种作用，对机体内微循环的调节具有重要意义。本试验旨从大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（RIMMVECs）分泌NO与ET-1的角度，探讨SLT-Ⅱe具体的致病机制以及穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe损伤RIMMVECs的作用机制。

1材料与方法

1.1材料

DMEM（Gibico）；标准胎牛血清（Gibico）；SLT-Ⅱe粗提物（扬州大学微生物实验室提供）；穿心莲内酯标准品（中国药品生物制品检定所）；大鼠肠黏膜微血管内皮细胞（北京农学院实验室提供）；NO试剂盒（深圳晶美公司）；ET-1试剂盒（上海尚柏生物公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠肠黏膜微血管内皮细胞传代培养

选取第10代的细胞进行消化, 所得细胞液用完全培养基稀释,将细胞密度调整到5 ×104 个?mL-1,充分混匀后接种至96孔的培养板中,每个孔接种0.2 mL，然后置入CO2 培养箱中静止培养48 h。

1.2.2试验前细胞计数

培养48h 后，定时消化三孔细胞作计数，当细胞数量增至1×105 个?mL-1 时，用于实验。

1.2.3分组方案

各孔细胞分为空白对照组、SLT-Ⅱe组、SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组和SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯2组。空白对照组加DMEM维持培养基，其余三组加含有10μg?mL-1 SLT-Ⅱe的DMEM维持培养基，2h后再向SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组和SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯2组分别加入终浓度为5 μg?mL-1、20μg?mL-1的穿心莲内酯液，置于CO2 培养箱中静置培养。

1.2.4取样

每组分6 h、12 h、18 h三个观测点，在各时间点取样测定细胞上清液中NO和ET-1的含量。

1.2.5测定

NO的测定用硝酸还原酶法,按照试剂盒说明操作,使用分光光度计于530 nm 处检测。

ET-1的测定用ELISA法，按照试剂盒说明操作，使用酶标仪于450 nm 处检测。

1.2.6数据统计

采用SPSS11.0统计软件处理。

试验结果采用平均值±标准误表示，试验组间差异采用t检验法。

2结果

2.1不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌NO的影响

表1　不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌NO的影响（治疗组）（±S μmol?L-1）(n＝3)

注：与空白组对照，** p＜0.01，* p＜0.05；SLT-Ⅱe组与SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组，SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯

2组对照，△△ p＜0.01，△ p＜0.05。

2.2不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌ET-1的影响

表2 不同浓度穿心莲内酯抗SLT-Ⅱe对RIMMVECs分泌ET-1的影响（治疗组）（±S pg?mL-1）(n＝3)

注：与空白组对照，** p＜0.01，* p＜0.05；SLT-Ⅱe组与SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组、SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯

2组对照，△△ p＜0.01，△ p＜0.05。

3讨论

NO与ET-1之间均以cGMP为中介，两者之间存在着反馈性调节，共同维持着正常的血管舒缩。两者分泌量一旦发生紊乱，势必破坏机体内正常微循环的进行。由表1和表2看出，SLT-Ⅱe组中NO的分泌量仅仅在第18h极显著高于空白组，在第6、12 h与空白组无显著差异；ET-1在第6、12、18h与空白组相比均极显著升高。分析原因可能是，微血管内皮细胞在受到SLT-Ⅱe刺激后，通过自身的保护机制发挥作用，ET-1首先开始分泌，以抑制NO―cGMP途径，使NO的分泌量在12h内未显著升高，细胞内的cGMP水平也未明显升高。作用一段时间后，SLT-Ⅱe逐渐发挥毒性作用，而细胞自身的保护力逐渐下降，出现了失代偿的状况，ET-1逐渐无法遏制NO的合成，NO大量分泌，ET-1反被NO抑制，分泌量呈逐渐下降的趋势。NO在18h达到分泌高峰，并通过NO―cGMP 途径，使细胞内的cGMP水平增高而导致血管舒张，进而使机体发生水肿。由此我们认为，SLT-Ⅱe致病机制主要是作用其靶细胞――微血管内皮细胞后，细胞通过自身保护力首先分泌ET-1来抑制NO分泌量的升高，但最终毒素的持续作用使细胞失去自身保护力，NO大量分泌导致微血管舒张，间隙增大，组织液进入组织间隙的量增多，造成组织水肿。在SLT-Ⅱe的致病机制中，NO是主要的致病因子，而ET-1作为与NO作用相反的细胞因子，在一定程度上可能起着保护微血管内皮细胞的作用。

穿心莲内酯目前已经成为抗心血管疾病常用中药之一。有研究表明，穿心莲内酯具有调节血管舒缩的作用。由表1和表2可以看出，SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯1组（5μg?mL-1穿心莲内酯）中NO的分泌量逐渐升高，且在12、18h高于空白组，差异极显著，较SLT-Ⅱe组差异不显著；ET-1分泌量各时间段均较空白组高，且呈略微下降趋势，较SLT-Ⅱe差异均不显著。分析原因可能是，5μg?mL-1穿心莲内酯对SLT-Ⅱe作用后的微血管内皮细胞保护力较弱或没有保护力。5μg?mL-1穿心莲内酯作用后，微血管内皮细胞迅速分泌ET-1，但是ET-1的分泌量较SLT-Ⅱe组没有显著的升高，无法抑制NO―cGMP途径，NO大量分泌，cGMP水平升高从而导致细胞的损伤。SLT-Ⅱe＋穿心莲内酯2组（20μg?mL-1穿心莲内酯）中NO分泌量略有降低，在各时间段与空白组均无显著差异，而在18h显著低于SLT-Ⅱe组；ET-1分泌量略有升高，各时间段极显著高于空白组，且极显著高于SLT-Ⅱe组。分析原因可能是，20μg?mL-1可以使ET-1在18 h内均保持较高的分泌量，抑制了NO―cGMP途径，使NO无法大量分泌，且分泌量能够回复到生理状态时的水平，进而起到保护微血管内皮细胞的作用。近年来穿心莲内酯对心血管方面的药理研究很多，但试验多以主动脉、脐静脉等为研究对象，对微血管方面的药理作用研究甚少。本试验的结果表明，不仅仅是对大动脉、大静脉，穿心莲内酯对机体的微血管同样有一定的调节作用。虽然具体的作用机制尚不清楚，但基本上可以认定，穿心莲内酯是通过刺激细胞分泌对细胞有保护作用的ET-1，来抑制SLT-Ⅱe刺激后分泌的主要的致病因子――NO的合成，从而达到治疗效果。这一结论再次验证了之前“在SLT-Ⅱe的致病机制中，NO是主要的致病因子，ET-1对内皮细胞有一定的保护力”的推测。

综上所述，NO分泌量的升高是SLT-Ⅱe引起肠黏膜微血管内皮细胞损伤的直接因素。微血管内皮细胞受到SLT-Ⅱe的作用，通过自身的保护机制，首先使ET-1快速升高，以抑制初期NO分泌量的升高，随后NO开始大量分泌而导致细胞损伤。此外，在18h时间段内，20μg?mL-1穿心莲内酯可以使SLT-Ⅱe作用后的ET-1保持稳定的分泌，NO分泌量不显著升高，从而对SLT-Ⅱe所致微血管损伤及微循环的障碍起到一定的治疗作用。