水貂肠炎病毒分子检测技术与基因工程疫苗研究进展

摘　要：水貂肠炎病毒(MEV)是一种自主复制性的最小的动物DNA病毒。研究表明，MEV是引起水貂病毒性肠炎的病原体，能够引起水貂剧烈腹泻，具有较高的发病率和死亡率。随着对水貂肠炎病毒研究的不断深入，目前已经在病毒病原学、结构与非结构蛋白、感染机制、诊断与疫苗防控等方面取得很大进展。文章主要针对MEV分子检测新技术与基因工程疫苗等方面进行了综述。

关键词：水貂肠炎病毒；分子检测；基因工程疫苗；防控

水貂肠炎病毒(Mink enteritisvirus，MEV)又名水貂细小病毒，是引起水貂以剧烈腹泻为主要临床特征的急性、烈性和高度接触性传染病的病原体。在自然条件下，不同品种和不同年龄的貂均有感染性，但幼貂的感染性极强。由MEV引起的水貂病毒性肠炎存在于世界各养貂国，该病最早于1949年由Schofield报道于加拿大，1952年由Wills分离鉴定了病原，并命名为水貂肠炎病毒，之后，美国、瑞典、荷兰、英国、法国、日本等相继报道。我国自从1981年姜廷秀报道发生疑似水貂肠炎病毒性肠炎以来，高云、于永仁、张德礼、王金生、张振兴、李昌仁、闫喜军等人先后报道，辽宁、吉林、黑龙江、河北、山东、青海、内蒙等地均有该病发生，并从发病或死亡的水貂中分离获得多个MEV病毒株。随着特种养殖业的发展，病毒性肠炎已经成为危害水貂养殖的三大疫病之一，给养貂业带来巨大的经济损失。

1　MEV的一般特征

MEV在分类地位上隶属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus)的成员，在同属中还有猫泛白细胞减少症病毒(Felinepanleukopenia virus，FPV)，犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV-2)，浣熊细小病毒(Raccoon parvovirus，RPV)和蓝狐细小病毒(Blue foxparvovirus，BFPV)等肉食兽细小病毒。MEV与FPV同源性非常高，认为是适应不同宿主的结果。MEV具有该属病毒的典型特征，呈20面立体对称结构，直径20nm～24 nm，无囊膜，分为实心和空心两种病毒颗粒，前者衣壳蛋白由VP1、VP2和VP33种结构蛋白组成，而后者只有VP1和VP2两种。MEV对外界因素有强大的抵抗力，对氯仿等脂溶性溶剂和胰蛋白酶有抵抗力。MEV是该属中血凝性较弱的病毒之一，仅在4℃，pH6.0～7.2条件下对猪和恒河猴的红细胞有凝集作用，也能凝集马和猫的红细胞，但Rivera等分离的MEV-S株对猪、猴或马、牛、恒河猴的红细胞均不表现凝集作用。MEV能在猫肾细胞系等多种猫源细胞培养物及水貂肾、脾、心肌细胞株培养中增殖，产生细胞病变。MEV为单股线性DNA分子，基因组长约5064nt，是动物DNA病毒中最小的。在基因组中含有两个主要的开放阅读框架，3′端编码结构蛋白，5′端编码非结构蛋白，即调节蛋白。2个启动子，分别位于图距单位37(37mu)和图距单位39(39mu)处，它能利用宿主细胞的RNA聚合酶Ⅱ分别启动结构蛋白(VP1和VP2)和非结构蛋白(NS1和NS2)编码基因的转录。VP1和VP2及NS1和NS2是通过同一条mRNA分别剪接后翻译形成的。

2　MEV的分子检测技术

自1949年，Schofield等首次报道水貂病毒性肠炎以来，有关该病诊断方法的研究报告较多。从最初的病毒分离鉴定，到血凝及血凝抑制试验、琼脂扩散试验、荧光抗体染色技术、酶联免疫吸附试验等免疫学方法，直到核酸杂交、聚合酶链式反应等分子生物学技术。

2.1　核酸杂交检测技术

核酸杂交技术是利用碱基互补原理来检测目的同源核苷酸片段，具有敏感性高、特异性强和诊断快速的特点。随着分子生物学技术的发展，核酸杂交技术被广泛地应用于各领域，如疾病诊断，特别是病毒病的诊断、基因杂交及文库筛选等。

在国外，UttenthalA等首次应用放射性同位素32P标记的探针杂交技术对试验中感染MEV的水貂进行分析。国内，赵永军等建立了用放射性同位素和光生物素标记的核酸探针，率先将核酸杂交技术应用于水貂病毒性肠炎的诊断。该技术将应用分子克隆技术制备的MEV0.7kb大小的DNA片段以及含有该片段的重组质粒pBM用放射性同位素32P标记，用光生物素标记pBM，分别制成放射性同位素和光生物素核酸探针。采用打点杂交技术检测5种肉食细小病毒和5种非细小病毒科病毒细胞培养物，以及33份貂、犬粪便样品，结果表明同位素32P标记的探针和光生物素标记的探针均具有相同的杂交特异性，与5种肉食兽细小病毒及感染细小病毒的貂、犬粪样呈杂交阳性反应，与其他科病毒及健康貂、犬粪样呈阴性。同位素32P和光生物素标记探针分别检出1pg和10pg貂肠炎病毒RF-DNA，敏感性比血凝试验分别高100倍和10倍，结果表明，这两种探针可作为肉食兽细小病毒临床诊断及流行病学调查的通用探针，而且这种方法对于检出长期潜伏感染、健康带毒动物和处于疾病早期或后期的动物具有重要意义。沈正达等建立了光生物素标记核酸探针检测MEV的方法，将重组质粒pEH20用HindⅢ酶切获得的2.5kb的DNA片段，进行光生物素标记，用该探针对MEV细胞培养物及其自然感染病料和对照材料检测。探针只与MEVDNA杂交显色，而与犬瘟热病毒、黏膜病病毒、阿留申病毒等其他9种病毒核酸不能杂交显色，且与血清学检测结果一致。也证明了用光生物素标记的核酸探针灵敏度相当高，可以检测出10pg DNA的水平。

2.2　聚合酶链反应检测技术

聚合酶链反应(Polymerase chainreaction，PCR)技术诞生于1985年，是一种体外扩增特定DNA片段的技术，它能快速、特异地在体外扩增特定的DNA片段，使之在短时间(数小时)内特异地扩增数百万倍，由皮克达到微克水平，经凝胶电泳后成肉眼能直接观察到的核酸条带。

刘维全等根据肉食兽细小病毒核苷酸序列高度同源的特点，设计合成了一对通用引物，以CPV、FPV和MEV细胞培养物为DNA模板，进行PCR扩增，结果均得到0.6kb的核酸片段。结果表明，扩增产物与设计的2个引物之间的序列大小一致。通过通用性、特异性与敏感性试验及对临床送检样品检测，证明此方法对肉食兽细小病毒通用，且具有快速、特异和高度敏感的特点。张海玲等根据GenBank中已经发表的MEV基因组序列，选择VP2基因的保守序列设计合成了一对特异性引物，建立了检测MEV特异性核酸的PCR诊断方法。经过敏感性及特异性检测，该引物能与MEV标准株和地方分离株核酸发生特异性结合，扩增出一段长度为570bp的DNA片段，而与犬瘟热病毒、阿留申病毒等病毒的PCR反应均呈阴性。表明设计引物可用于MEV的临床检测。DecaroN等建立了快速、敏感和重复性高的RT-PCR，能够检测出粪便中的102～109数量级的DNA拷贝；随后又建立了能鉴别CPV疫苗毒和野毒的基于小沟聚合物(minorgroovebinder，MGB)荧光探针技术的RT-PCR；到2008年又发展了基于MGB探针的实时RT-PCR用于FPV和CPV的鉴别诊断。EliaG等建立的实时RT-PCR用于检测CPVNS2的mRNA，能够在感染犬的多种组织中，包括中枢神经系统，检测出RNA拷贝，其检测范围为102～109数量级。

2.3　基因组的限制性内切酶图谱

病毒基因组的限制性内切酶图谱，又称物理图谱，是指描绘病毒双链DNA上各种不同限制性内切酶的酶切位点分布情况、限制性片段大小及其排列顺序的图谱。病毒DNA经内切酶水解，进行凝胶电泳，可观测清晰的条带。于这一特性，人们可以制备准确的病毒基因组核酸酶切图谱，利用不同的内切酶切割病毒DNA，依据切割后的片段在凝胶电泳中泳动速率不同所形成的电泳条带作出诊断。该方法可用于肉食兽细小病毒的鉴别诊断上。

McMastcr GK等用25个限制性内切酶比较CPV和MEV，发现产生的79个酶切位点中只有11个位点不同，86%的位点是相同的，其中用HacⅢ酶切CPV和MEV只有1个位点不同。TratschinJD等用7个限制性内切酶分别酶切FPV和MEV，结果两个毒株的全部位点中只有一个位点不同，而且MEV和FPV疫苗株的图谱与各自野毒株的图谱很相似。王惠琛等经限制性内切酶分析，MEVRF-NDA有2个HindⅢ酶切位点，1个PstⅠ酶切位点和1个EcoRⅠ酶切点。刘士英等应用HindⅢ酶切MEV、豹细小病毒(LPV)、CPV和RPV 4种细小病毒的RF-DNA都产生3个酶切片段，分别为2.5、1.8 、0.9kb；应用HacⅢ酶切，MEV产生3个酶解片段，分别为2.28、1.78、1.35kb，其余3种病毒产生4个相同的酶解片段，分别为1.74、1.32、1.2、0.76 kb，从而可将MEW与其余3种病毒明显地区别开。

3　基因工程疫苗的研究

研究表明，尽管MEV的常规疫苗在水貂病毒性肠炎的预防控制中起到了十分重要的作用，但是各种常规疫苗均有不同程度的缺陷和不足，如组织灭活疫苗存在不良反应及潜在污染的威胁，细胞培养灭活疫苗免疫效果不稳定，以及弱毒疫苗发生重组及毒力返强的潜在威胁等。因此，研究和开发更为安全有效的基因工程疫苗将成为水貂病毒性肠炎免疫预防研究的主题与热点。

3.1　基因工程亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗是利用DNA重组技术，将编码病原保护性抗原的基因导入原核或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达，然后提取保护性抗原多肽，加入佐剂制成的疫苗。继Lópezde Turisod J A等应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功表达了CPV VP2蛋白之后，ChristensenJ等也应用该系统成功表达了MEVVP2蛋白。首先通过PCR法从自然感染MEV的水貂粪便中扩增出VP2基因，将其克隆到杆状病毒表达载体中，筛选得到了重组杆状病毒。将其转染sf9昆虫细胞，结果成功表达出VP2蛋白。表达的重组VP2蛋白与MEV野毒株VP2蛋白大小完全一致，并且能形成病毒样粒子，同时也具有血凝活性。用4×104个血凝活性单位的重组VP2蛋白免疫水貂可诱导机体产生HI抗体，并且对MEV强毒的攻击能产生良好的免疫保护作用，免疫动物接种强毒后不排毒，没有临床症状。此外，国外已有CPV基因工程多价亚单位疫苗的报道，PatialS等采用PCR方法将狂犬病病毒糖蛋白基因和CPVVP2基因分别定向克隆入真核双表达载体中，免疫小鼠和犬能够抵抗狂犬病病毒和CPV的攻击。

3.2　基因疫苗

基因疫苗又称核酸疫苗或DNA疫苗，是将编码某种目的抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制之下，并将其直接导入动物机体内，通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防传染病的目的。这种能诱导动物机体产生免疫应答的真核表达质粒就是基因疫苗。目前尚未有MEV基因疫苗研究的报道，但国内外已经开展了与MEV抗原关系密切的CPV基因疫苗的研究。陈芹运用PCR技术扩增了CPV-YZ株两个长约1.7kb的VP2基因片断(3′端有和无CpG基序)，以pGEM-T为载体成功构建了犬用重组真核表达质粒pcDNA3-VP2、pcDNAC1-VP2、pCEP4-VP2和pCEPC1-Vp2，用这4种核酸疫苗对Balb/c小鼠进行免疫。结果表明，注射小鼠的血清中含有较高的CPV特异抗体，其中pcDNAC1-VP2产生的抗体最高。用上述4种重组质粒免疫毕格犬，结果表明，4种重组质粒均产生抗CPV特异抗体。对基因疫苗注射犬进行的攻毒保护试验结果显示，pcDNA3-VP2和pcDNAC1-VP2免疫组的存活率分别为25%和50%，而pCEP4-VP2和pCEPC1-Vp2免疫组无犬存活。在上述试验的基础上，又成功构建了犬用重组真核表达质粒pcDNAKC2-VP2，经免疫毕格犬其血凝抑制价高于pcDNAC1-VP2，可用于CPV基因疫苗的进一步研究。随后不同作者也进行了CPV基因疫苗的研究。

3.3　基因工程重组活载体疫苗

基因工程重组活载体疫苗是用基因工程技术将保护性抗原基因插入到微生物载体中使之表达的活疫苗。痘病毒、腺病毒和疱疹病毒等病毒都可以用于活载体疫苗的制备。目前尚未有MEV基因工程重组活载体疫苗研究的报道，但国内外已经开展了与MEV抗原关系密切的FPV基因工程重组活载体疫苗的研究。HuL等应用貉痘病毒为载体，通过同源重组的方法构建了含有FPVVP2蛋白基因表达盒的重组痘病毒。以此重组病毒对猫进行免疫，能抵抗FPV强毒的攻击，具有良好的保护性。9只免疫猫在攻毒前血清中FPV中和抗体效价都很高，而未免疫猫在攻毒后才能检测到FPV中和抗体。次年HuL等又应用貉痘病毒为载体构建了含有FPV VP2和狂犬病病毒G糖蛋白基因的双价重组貉痘病毒，结果证明，也具有保护性。Hu L和YangS T等应用犬2型腺病毒为载体，通过同源重组的方法构建了含有FPVVP2蛋白基因表达盒的重组腺病毒。以此重组病毒对猫进行免疫，免疫后45 d中和抗体效价可达1∶64～1∶128，能抵抗FPV的攻击，具有良好的保护性。

3.4　合成肽疫苗和表位疫苗

合成肽疫苗是用化学合成法人工合成病原微生物的保护性多肽，并将其连接到大分子载体上，在加入佐剂制成的疫苗。表位疫苗是通过确定抗原蛋白的B细胞、Th细胞以及CTL细胞识别的表位，经人工合成，并与大分子载体连接，加入佐剂制成；也可通过基因工程技术表达抗原蛋白表位多肽，或表达与大分子蛋白的融合蛋白制成。LangeveldJD等研制的合成肽疫苗和表位疫苗具有很好的保护水貂抵抗MEV感染的效果，具有与传统灭活疫苗相同的效果。给每只动物免疫一次，每次的剂量是150μg(合成肽)或3 μg(重组VP2蛋白)，就能使动物获得全面有效的保护。

3.5　转基因植物疫苗

转基因植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合，生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。DalsgaardK等应用豇豆花叶病毒-植物细胞表达系统成功表达了MEV VP2蛋白。首先将编码MEVVP2上具有线性表位多肽的一段基因，克隆到豇豆花叶病毒表达载体中，筛选得到了重组豇豆花叶病毒。将其转染豇豆细胞，结果成功表达出含VP2蛋白抗原决定簇的嵌合病毒粒子。用1mg的嵌合病毒粒子免疫水貂可诱导机体产生抗体，并且对MEV强毒的攻击能产生良好的免疫保护作用，免疫动物接种强毒后不排毒，没有临床症状。因为MEV的VP2基因表达后能自我形成类病毒粒子，这对保持其免疫原性是非常重要的。另外，VP2基因表达的类病毒粒子可以作为其他抗原的转运载体，这为开发多价的转基因植物疫苗提供了条件。

4　结语

随着分子生物学的发展，PCR、核酸杂交等分子检测技术已经成为MEV免疫学方法检测的重要补充，从而大大提高了水貂病毒性肠炎的诊断水平。而疫苗预防工作也有较大的进展，表现在多种基因工程疫苗的研究开发上，从而避免了组织灭活疫苗的不良反应及潜在污染的威胁，细胞培养灭活疫苗免疫效果不稳定，以及弱毒疫苗发生重组及毒力返强的潜在威胁等。由于细小病毒的免疫主要是体液免疫，可采用颗粒性的亚单位疫苗来免疫；再者细小病毒的基因较小，也容易在载体上获得表达；加之细小病毒的衣壳蛋白体外表达时可自主装配，能自动形成完整的病毒样颗粒，具有较好的免疫原性。从而加快了MEV基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗和表位疫苗、转基因植物疫苗等基因工程疫苗的研究，MEV基因疫苗将有很好的发展前景。