山羊痘病毒载体研究进展

摘　要：山羊痘病毒(GPV)为痘病毒科，羊痘病毒属的一个成员，基因组呈线性，全长约150kb，编码147个开放阅读框。GPV的胸苷激酶基因是复制非必需基因，插入外源基因而不影响病毒复制，TK基因具有高度保守性，可以作为构建重组病毒的同源臂。GPV宿主范围小，对人不具有感染性，对外源基因的耐受性强，是一种更为理想的活病毒载体。国外的研究人员已经构建了多种表达外源基因的重组GPV，我国的相关研究刚刚起步，随着对GPV研究的进一步深入，重组GPV病毒在预防反刍动物疫病中将会发挥重要作用。

关键词：山羊痘病毒；基因组；载体；应用

绵羊痘和山羊痘是绵羊和山羊的病毒性疾病，是家畜中最重要的痘病，两种羊痘的病原均为山羊痘病毒，系OIE规定的通报动物疫病。羊痘主要在中非、北非、中东、印度等地呈地方性流行，该病在我国也常见报道，有的地区呈暴发流行。

山羊痘病毒(Goatpoxvirus，GPV)和其他痘病毒一样，病毒基因组保守区的非复制区域可以整合外源DNA，GPV是继痘苗病毒(Vaccina virus，VV)和禽痘病毒(Fowlpox virus，FPV)之后又一种重要的动物病毒载体。国内外已经有不少关于山羊痘病毒载体研究的报道，主要集中在重组山羊痘病毒疫苗方面的研究。山羊痘病毒载体不仅能够预防羊痘的发生，还可以通过插入其他外源病毒保护性抗原，诱导产生针对相应病原的免疫应答。重组病毒所表达的外源基因在机体内随载体病毒的复制而表达，与灭活苗相比，它容易生产，免疫剂量小，接种方法简便，接种一次就能获得长期的免疫效果，大大降低了生产成本。

1　山羊痘病毒的基本特性及基因组

山羊痘病毒是痘病毒科(Poxviridae)、脊索动物痘病毒亚科(Chordopoxrinae)，羊痘病毒属(Capripoxvirus)成员。GPV可以感染所有品种、性别和年龄的山羊，其中羔羊最易感，感染率可达100%。GPV通过接触痘疹破损后的皮肤、呼吸道的吸入或者媒介的传播而感染其他山羊，同群间传播迅速，但一般不向其他羊群散播。山羊痘病毒对干燥有较高的抵抗力，干燥痂皮内的病毒可以存活3个～6个月，在干热达100℃时，仍可存活5 min左右。对常用消毒剂有较强的抵抗力，但500 mL/L酒精和0.1 g/L KMnO4可以在1h内将其灭活。对***和氯仿敏感。反复冻融对其没有明显的灭活作用。GPV在鸡胚绒毛尿囊膜上生长，并产生痘斑和结节性病灶。GPV还可以在原代羔羊睾丸(lamb testicle， LT)细胞和羔羊肾 (lamb kidney， LK)细胞上繁殖。RamyarH等将山羊痘病毒通过绵LK细胞100代，获得了一株对山羊几乎无毒但仍保有较好免疫原性的弱毒株。

GPV基因组由共价结合的双股DNA组成，基因组呈线性，全长约150kb，DNA无感染性，编码至少147种基因。基因组中心约145kb的区域比较保守，编码的蛋白主要参与DNA复制、转录，蛋白合成、加工等。其基因组两端的序列变化较大，可能与病毒的毒力和宿主特异性有关。

GPV基因组中AT含量约75%，在整个基因组中均匀分布。基因组的编码区共有147个开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码密度为93%，所编码的蛋白为53个～2027个氨基酸不等。具体每个基因的功能目前还研究的比较少，大多是根据痘苗病毒推测而来的。

胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因在各类真核细胞和病毒中广泛存在，作用基本一致，其表达的是催化胸苷被ATP磷酸化形成胸腺嘧啶脱氧核苷酸的酶，是合成胸苷酸补救途径的限速酶，在核酸代谢中起着重要作用。TK基因通常是病毒复制的非必需基因，但TK基因同时也是痘病毒的毒力相关基因。通过基因工程技术使TK基因缺失后，病毒毒力降低，但其免疫原性不变。目前研究较多是痘苗病毒的TK基因，国内外已经有痘苗病毒载体使用TK基因作为同源臂的许多研究。近年来，在禽痘病毒和山羊痘病毒载体中的研究事实都证明，TK基因也是痘病毒复制非必需基因。GPV的TK基因位于基因组中部，全长约534bp，编码177个氨基酸多肽。同源性比较显示，我国GPV疫苗毒株TK基因的和其它参考毒株同源性为95%～100%，与同属的绵羊痘病毒，牛疙瘩皮肤病病毒同源性在96.1%以上，这证明了TK基因的保守性。

2　山羊痘病毒载体的优点

①GPV宿主范围窄，仅感染山羊，绵羊和牛等反刍兽，对其他哺乳动物和人类不具有感染性和致病性，使用起来比较安全；②GPV弱毒苗已经被广泛应用于绵羊痘和山羊痘的预防，所以用GPV作为疫苗载体不会引入新的病毒；③GPV基因组结构背景明确，遗传稳定性强，基因组容量大，对外源基因插入耐受性强，至少可以容纳长达25kb的外源片段而不丧失感染力，因此，可以将不同的外源基因，特别是各种病毒的保护性抗原基因一同插入山羊痘痘病毒TK基因进行复制；④痘病毒接种一次就能获得比较长的免疫效果，既可以引起体液免疫又能引发细胞免疫，能诱导抗外源抗原的抗体和细胞毒性T细胞的反应；⑤重组疫苗只含有病原微生物特定的抗原成分，可以区别野毒感染的动物和重组疫苗接种的动物，不会干扰疫病的血清学检测；⑥GPV在自然界中很常见，存在于细胞浆中，利用病毒编码的聚合酶进行病毒的复制和转录。因此，没有必要担心痘病毒的基因组会整合到宿主细胞的基因组中。

3　山羊痘病毒载体的构建

GPV基因组庞大而复杂，不易在某一个特定的位置直接插入外源基因，所以要先利用一个质粒载体构建一个转移载体。该载体中含有GPV基因复制非必需基因的同源臂，在同源臂内部插入外源基因片段。然后与GPV一起共转染山羊痘病毒敏感细胞(LT或LK，因为痘病毒的基因组不具有感染性，需要GPV的辅助提供聚合酶)。转染后，通过GPV基因组和转移载体上非必需基因的同源重组，外源基因插入痘病毒基因组中。通过定向纯化，最终获得具有所赋予的新的特性的基因缺失的重组GPV。

构建GPV转移载体，首先提取GPV的基因组DNA，PCR扩增其非必需基因，连接到合适的载体上，并将其非必需基因切开，分为左右同源臂，再用合适的酶切下所需要的启动子，连接到已经连上了非必须基因的载体上游，最后在启动子的下游插入外源片段或者具有特殊筛选标志的基因。另一种更为简便的方法是根据GenBank上的GPV序列，把TK基因序列和启动子序列连同设计好的多克隆位点，由生物工程公司合成，连接到合适的载体上。然后在在启动子下游插入需要的外源基因和具有特殊标志的筛选基因。

GPV载体系统的筛选一般采用β-半乳糖苷酶(LacZ)基因或增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescentprotein，EGFP)作为报告基因，黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(xanthine-guanine phoshporibosyltransferase，gpt)基因作为压力筛选基因。LacZ基因利用β-半乳糖苷酶基因的表达颜色筛选。EGFP在包括热、极端pH和化学变性剂等苛刻的条件下都很稳定。在真核细胞内的环境中，也可以持续发光。是一个比较优秀的标签基因。gpt基因来自大肠埃希菌，病毒或细胞在霉酚酸(MPA)存在的情况下，由于MPA可以阻断鸟嘌呤合成，使病毒或细胞核酸合成不能正常进行而死亡。而在gpt基因存在下，细胞或病毒可以利用次黄嘌呤(hypoxanthine)和黄嘌呤(xanthine)通过替代途径合成鸟嘌呤，使核酸合成不受限制。因而可以将gpt基因插入疫苗载体中进行筛选。

4　重组病毒的纯化

一般重组病毒的纯化均采用蚀斑纯化的方法。在标签基因已经表达的情况下，将已经转染完的病毒液进行病毒稀释并接种到其易感细胞，挑取病毒稀释度最高的具有重组病毒的表型的病毒蚀斑，并将此蚀斑继续做蚀斑传代，或者96孔板做病毒梯度稀释接种。依次往下传，直到最后纯化出完全纯化的蚀斑为止。重组病毒可以经过PCR来鉴定。

5　山羊痘病毒载体的应用

世界各国利用弱毒疫苗预防羊痘已经有很久的历史，但是弱毒疫苗容易造成病毒的传播，预防疾病单一等缺点，随着对其他痘病毒载体的深入研究，具有诸多优点的山羊痘病毒进入了科学家的视野。

Romero C H等构建了一个包含牛瘟病毒(Rinderpestvirus，RPV)RBOK疫苗株完整融合蛋白基因(F基因)的重组山羊痘病毒，F基因置于其晚期启动子P11的控制下，筛选基因gpt基因置于与P11方向相反的P7.5启动子下方。动物试验表明，其疫苗不仅能够保护动物不被毒力较强的牛瘟病毒感染，而且对牛疙瘩皮肤病(Lumpyskin disease virus， LSDV)的感染也有保护作用。Romero CH等构建了一个包含牛瘟病毒RBOK疫苗株的完整H基因的重组山羊痘病毒，血凝素蛋白基因(H基因)置于P11下游。在免疫牛体内能检测到该重组毒产生的较高水平的RPV中和抗体，并且能够保护动物不被致死剂量的RPV引起临床感染。使用低于1993年F重组毒的免疫剂量就能够实现保护作用。同年，Romero T等用构建完成的分别表达RPV的F和H基因的重组毒以用于保护小反刍兽疫(Peste des petitsruminants，PPR)，在免疫过的山羊，H基因能在其体内产生较高滴度的病毒中和抗体。而F基因产生较少的中和抗体，甚至不能被检测到，和在牛体内所得到实验结果一致。该重组苗除了能保护牛同时预防了RPV和LSDV的攻击，还具有对人无致病性，接触比较安全的优点。

在牛瘟病毒重组山羊痘病毒的研究基础上，Wade-Evans A M等构建了蓝舌病病毒(Blue tongue virus，BTV) VP7基因的重组山羊痘病毒。Diallo A等构建了表达小反刍兽疫病毒(Peste des petitsruminants virus， PPRV)H基因的重组山羊痘病毒，动物试验中需要10 TCID50才能保护小反刍兽疫。BerheG等构建表达PPRV F基因的重组山羊痘病毒，动物试验表明只需要0.1TCID50对山羊产生保护作用。2007年，法国研究人员构建了分别表达BTV结构蛋白(VP2和VP7)和非结构蛋白(NS1和NS2)重组羊痘病毒，并在山羊和绵羊体上进行了免疫原性和保护性试验，结果在山羊和绵羊血清中都检测到了抗体，但对BTV的保护率不高，这与Wade-EvansAM的报道结果不一致，这可能与BTV蛋白在重组病毒中表达量不足有关。

目前所有的重组GPV还都是只表达了一个外源保护性抗原，由于GPV具有插入多个外源片断的优势，同时在TK基因中插入一个病毒的多个保护性抗原或不同病毒的保护性抗原的研究还未见报道，在重组金丝雀痘病毒(Canarypoxvirus)研究中，同时插入了BTV的VP2和VP5基因进行共表达，在绵羊体内实验表明，不但可以产生高滴度的中和抗体，而且对BTV的感染具有高的保护率。构建同时表达两个及两个以上外源基因的重组GPV今后应该加强研究。

我国对GPV载体的研究刚刚起步，程小文等和鞠厚斌等分别构建表达EGFP的重组山羊痘病毒，但未见后续报道。王芳等构建了表达LacZ基因的重组GPV并对其生物学特性进行了初步研究。

6　结语

分子生物学的迅速发展为重组病毒的构建提供了理论和方法，但一个好的载体系统首先要求有强的启动子，但目前GPV载体多采用痘苗病毒或禽痘病毒的启动子，启动表达效率还不高。如何优化提高山羊痘病毒载体启动子的表达启动效率，是今后应重点研究的内容。另外，在重组GPV的筛选过程中，一般采用的LacZ基因和EGFP基因为标签基因，gpt基因作为压力筛选基因，而这些报告基因在动物体内的表达产物是否能影响目的抗原的免疫原性尚有待探索。相信随着对GPV研究的深入，必将对上述问题给出答案，使重组羊痘疫苗具有更好的免疫力和安全性。