猪亚利桑那菌及其质粒的耐药性研究

摘　要：在普通平板上对猪亚利桑那菌进行药敏试验，测知最敏感的抗菌药是头孢拉定。之后测得头孢拉定的最小抑菌浓度(MIC)为0.125mg/mL，最小杀菌浓度(MBC)为0.25 mg/mL。将猪亚利桑那菌菌液接种于浓度为MIC的头孢拉定药液，37 ℃培养24h后进行药敏试验，发现猪亚利桑那菌对先锋噻肟最敏感。猪亚利桑那菌存活率逐渐降低，24h时存活率为0。另外，提取猪亚利桑那菌质粒，研究其耐药性，发现猪亚利桑那菌质粒对很多抗菌药物有很强的抵抗力。

关键词：猪亚利桑那菌；药物敏感性；质粒

猪亚利桑那菌是对动物健康影响极大的一类有害菌，严重时可导致动物死亡。研究发现，猪亚利桑那菌感染小鼠后，可使小鼠组织器官受损，引起小鼠死亡。临床上猪亚利桑那菌对仔猪及怀孕母猪均有明显的危害性。

由于亚利桑那菌严重的危害性，目前在治疗上仍旧离不开抗菌药换的使用。本试验拟通过对猪亚利桑那菌耐药性的研究，了解猪亚利桑那菌与抗菌药物之间的相互作用关系，为临床防治猪亚利桑那菌病提供参考依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

猪亚利桑那菌，由西北农林科技大学禽病实验室提供。

麦康凯琼脂、普通肉汤、营养琼脂，均按常规方法制备。

药敏纸片，杭州天和微生物试剂有限公司生产。

头孢拉定，哈药集团制药总厂生产。质粒提取试剂盒，上海史瑞可生物科技有限公司提供。

1.2　方法

1.2.1　细菌复苏　将保存的猪亚利桑那菌菌种解冻后接种于普通肉汤，置恒温箱37 ℃培养24 h，染色镜检观察有无杂菌。

1.2.2　药敏试验　用加样器吸取50μL的亚利桑那菌肉汤培养物接种于营养琼脂平板，用楔形玻璃棒将其涂布均匀，再将药敏纸片贴于普通平板上，压实，先放入4 ℃冰箱2h，再拿出，放置于恒温培养箱中37 ℃，培养24 h后观察结果，筛选对细菌最敏感的抗菌药进行下一步试验。

1.2.3　最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)试验

1.2.3.1　菌液稀释液制备　将培养24 h后的猪亚利桑那菌液体培养物进行倍比稀释，稀释后的菌液接种于麦康凯平板，置于恒温培养箱37℃培养24 h后观察纪录菌落生长情况；之后根据测定结果将猪亚利桑那菌液体培养物稀释到106cfu/mL。

1.2.3.2　MIC和MBC的测定

用试管二倍稀释法操作。

MIC、MBC确定方法：培养管肉眼观察清亮且菌落记数结果小于5个为MBC，培养管肉眼观察清亮且菌落记数结果小于106个为MIC。试验完后将各管放入4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.4　猪亚利桑那菌耐药性变化　配制浓度为MIC的药液，取1 mL猪亚利桑那菌菌液接种于1 mL MIC药液中，37℃恒温培养24 h后进行药敏试验，观察并记录结果。

1.2.5　猪亚利桑那菌在抗生素中的存活曲线　配制浓度为100 MBC的抗菌药液10 mL。取药液0.1 mL，加入8.9 mL于37℃预温的营养肉汤中，混匀后取细菌悬液(106cfu/mL)1 mL加入该肉汤中，37 ℃恒温培养，分别于0、1、2、3、4、6、8、12、24h取培养液进行细菌计数。将细菌计数所取的各个时间点菌液浓度取常用对数(log10)，并以其为纵轴，以培养时间为横轴建立猪亚利桑那菌在抗生素中的存活曲线。

1.2.6　猪亚利桑那菌质粒耐药性研究　扩增猪亚利桑那菌，提取质粒；将质粒转染于感受态工程菌(大肠埃希菌)之后，接种于LB抗性筛选平板37℃恒温培养12 h，挑取生长的大肠埃希菌菌落进行药敏试验。

2　结果

2.1　药敏试验

由表1可知，对猪亚利桑那菌最敏感的抗菌药是头孢拉定，其次是头孢曲松和环丙沙星。

表1　药敏试验结果

Table 1　The results ofdrug sensitivity test

注：抑菌直径<10 mm为不敏感；10 mm≤抑菌直径15 mm为中度敏感；抑菌直径≥15mm为高敏感。

Notes：Diameter of inhibitory circle less than 10 mmis notsensitive；Diameter of inhibitory circlenot less than 10 mm and lessthan 15 mmis sensitive；Diameter of inhibitory circle not less than15 mm is high sensitive.

2.2　头孢拉定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)试验结果

由表2可见，头孢拉定对猪亚利桑那菌的最小抑菌浓度为0.125 mg/mL，最小杀菌浓度为0.25 mg/mL。

表2　头孢拉定的MIC与MBC试验结果

Table 2　The result of Cefradine’s MIC and MBC test

注：“－”表示试管清亮无沉淀；“＋”表示试管内浑浊有沉淀。

Notes：“－”means no precipitate inthe tube；“＋”means the precipitatein the tube.

2.3　浓度为MIC的头孢拉定影响下的猪亚利桑那菌药敏试验

由表3可知，猪亚利桑那菌对头孢拉定耐药性产生后，对多种抗菌药的敏感性发生改变，其中，对先锋噻肟变得最为敏感。

2.4　细菌存活曲线结果

不同时间猪亚利桑那菌生长数量见表4和图1。

由表4和图1可知，随培养时间延长，猪亚利桑那菌存活率逐渐降低，在24 h时猪亚利桑那菌存活率为0；而对照组细菌增殖一直呈上升趋势。

表3　药敏试验结果

Table 3　The results of drug sensitivity test

表4　细菌生长数量结果

Table 4　The growing numbers of swineArizona

图1　不同时间猪亚利桑那菌生长数量

Fig.1　The growing numbers of swineArizonain different time

2.5　猪亚利桑那菌质粒耐药性结果

由表5可知，猪亚利桑那菌质粒对氟哌酸、环丙沙星、万古霉素、妥布霉素、卡那霉素、复方新诺明、氨苄青霉素、青霉素、庆大霉素、阿米卡星、链霉素、红霉素、苯唑青霉素、先锋霉素V、头孢呋肟、头孢拉定产生耐药性，对氧氟沙星、氧哌嗪青霉素、利福平、四环素、先锋噻肟、菌必治低敏；对头孢他啶、先锋必高敏。

表5　质粒药敏试验结果

Table 5　The results of plasmid’s drug sensitivity test

3　讨论

在MIC影响下的药敏试验与原药敏试验相比发生了许多变化，猪亚利桑那菌对大多数抗菌药的敏感性下降。其中，万古霉素、利福平由中度敏感变为不敏感，链霉素由高敏感变为中度敏感，头孢拉定的敏感性下降，先锋噻肟成为最敏感的抗菌药。因此，在临床治疗时，要注意各种抗菌药的相互影响，不能随意混用抗菌药。且用药量应到位，保证一次性彻底治愈，防止出现耐药性。如果患病猪群用头孢拉定治愈后又患此病，应考虑用先锋噻肟代替头孢拉定来治疗。

在MIC、MBC测定上，一般都是眼观细菌的生长情况，按抗生素浓度由大到小的顺序排列，肉汤清亮的最靠后的那管的浓度就是MBC的浓度，下一管就是MIC的浓度。在本次试验中，眼观与菌落计数相结合，结果确实，值得参考。同时，提取猪亚利桑那菌质粒进行耐药性研究，发现质粒对许多抗菌药有抵抗力，这说明猪亚利桑那菌质粒对抗菌药有很强的抗药性，有关其抗药性的机制还应做进一步研究。