鹅源大肠埃希菌的分离与鉴定

摘　要：从临床疑似大肠埃希菌感染的病雏鹅的组织分离到31株细菌，通过培养特性和生化试验确定其中27株为大肠埃希菌。血清学试验表明，其中7株(25.93%)为O26型，6株(22.22%)为O78型，4株(14.81%)为O1型，3株(11.11%)为O18型，2株(7.41%)为O117型，5株(18.52%)未能定型。应用PCR方法检测了27株大肠埃希菌的F1菌毛与毒力岛HPI基因，结果表明24株(88.89%)为F1＋大肠埃希菌，7株(25.93%)为HPI＋大肠埃希菌(其中4株为F1＋)。药敏试验表明，所有菌株均对头孢唑林、呋喃妥因敏感，部分菌株对庆大霉素、环丙沙星敏感，而对多黏菌素、四环素、林可霉素均为耐药。

关键词：鹅；大肠埃希菌；分离；鉴定

随着规模养殖的扩大和产品流通的日益频繁，大肠埃希菌引起原发性或继发性感染一直是养殖业中令人头痛的问题，尤其对集约化养殖场造成的直接或间接经济损失难已估量，已成为影响养殖业快速发展的重要疾病之一。扬州市是江苏省重要的养鹅地区，已经成为提高农民收入、促进农村发展、提高农业水平的重要支撑，因此，做好鹅病防控应该成为科研工作者关注和关心“三农”工作的重要着眼点。通过对扬州市某地区鹅源大肠埃希菌的分离培养、抗原性鉴定、毒力因子检测及耐药性分析，对该病的防治有着重要的价值。

1　材料与方法

1.1　病料

收集来自江苏省扬州地区2008年3月份～4月份的临诊疑似大肠埃希菌感染的病雏鹅，采集肝脏作为分离细菌的材料。

1.2　参考菌株

F1菌毛阳性(F1＋)大肠埃希菌1253-77株、C121v-77株、C600株，毒力岛HPI阳性(HPI＋)大肠埃希菌S452621株、S433014株及其他菌株等，均为扬州大学兽医微生物教研室保藏菌株。

1.3　培养基

麦康凯琼脂为上海中科昆虫生物技术开发有限公司产品；LB培养基、三糖铁琼脂等均根据文献配制。微量生化培养管与药敏纸片均为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.4　PCR引物

根据GenBank中发表的F1菌毛主要结构蛋白基因(fimA)及毒力岛HPI标志基因(irp2)序列，设计了2对引物分别用于F1菌毛(F1-F：AATGCCGGCGCTCTGTTGATCAAACCGT，F1-R：AGATACTGAACCTTGAAGGT CGCATC)和HPI(irp2-F：AAGGATTCGCTGTTACCGGAC，irp2-R：TCGTCGGGCAGCGTTTCTTCT)的PCR检测；所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5　主要试剂

PCR试剂、DNA Marker DL 2000等均购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖为西班牙Biowest产品；大肠埃希菌O因子血清购自中国兽药监察所；吲哚试剂、MR试剂、VP试剂、革兰氏染色液均根据文献配制。

1.6　细菌的分离

取采集的病料在麦康凯琼脂平板上进行划线分离；37 ℃培养24 h～48h后，挑取疑似大肠埃希菌菌落，再在麦康凯琼脂平板上连续培养3代，以获得细菌的纯培养物。取所有分离株的纯培养物进行革兰氏染色镜检，并分别于三糖铁琼脂37℃培养24 h后观察生长情况。

1.7　生化试验

IMViC试验、糖类分解试验、尿素分解试验、硫化氢产生试验等均按照文献进行。

1.8　O抗原型鉴定

取所分离的大肠埃希菌在LB平板上的培养物，用灭菌生理盐水漂洗3次后，制成约1×1010cfu/mL的悬液；121 ℃高压蒸汽处理1 h后，使用已知大肠埃希菌O因子血清，通过玻板凝集试验进行O抗原型鉴定。

1.9　细菌DNA模板的制备

所有参考菌株和分离菌株均在LB平板上37 ℃培养24 h，各挑取1个菌落并分别均匀悬浮于50 μL超纯水中；100 ℃煮沸10min后，迅速冰浴5 min；10 000 r/min离心5 min，取上清即可用于PCR检测。

1.10　检测F1菌毛的引物特异性

取10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，4×dNTPs(10 mmol/L)4 μL，引物F1-F与F1-R(均为50 μmol/L)各1μL，Taq酶(5 U/μL)1 μL，参考菌株的DNA模板2 μL，加H2O至为50 μL。PCR循环参数如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 0.5 min，58 ℃ 0.5 min,72 ℃ 1min，共30循环；72 ℃ 10 min,4 ℃保存待用。

1.11　检测HPI的引物特异性

取10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，4×dNTPs(10 mmol/L)4 μL，引物irp2-F与irp2-R(均为50μmol/L)各1 μL，Taq酶(5 U/μL)1 μL，参考菌株的DNA模板2 μL，加H2O至50 μL。PCR循环参数同1.10。

1.12　PCR产物的凝胶电泳

取PCR扩增产物4 μL进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker DL 2000为参照，溴化乙锭(EB)染色后置紫外灯下观察扩增片段大小。

1.13　分离菌株F1和HPI的PCR检测

取鹅大肠埃希菌分离株的DNA模板，分别用步骤1.10、1.11进行扩增，以步骤1.12进行凝胶电泳，从而确定鹅大肠埃希菌的F1菌毛或HPI携带情况。

1.14　药敏试验

取所有分离菌以纸片琼脂扩散法测定其对环丙沙星、四环素、头孢唑林、林可霉素、庆大霉素、多黏菌素、呋喃妥因共7种抗菌药物等敏感性。

2　结果

2.1　细菌分离结果

病料在麦康凯琼脂平板上37 ℃培养24 h，均有大量圆形凸起、光滑、湿润、红色菌落，直径约1 mm～2mm。将疑似大肠埃希菌菌落进行纯培养后获得31株细菌，三糖铁琼脂培养24h后，其中27株斜面变黄、底部变黄、产气，4株斜面变红、底部变黄、产气。所有细菌均为中等大小的G－杆菌。

2.2　生化试验结果

所有在三糖铁琼脂斜面变黄的27菌株IMViC反应均为＋＋DD，不分解尿素，不产生硫化氢，均分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖产酸产气，其中4株分解蔗糖。而在三糖铁琼脂斜面变红的4菌株IMViC反应均为－＋DD。

2.3　O抗原型鉴定

以O抗原单因子血清进行的玻板凝集结果发现，其中7株(25.93%)为O26型，6株(22.22%)为O78型，4株(14.81%)为O1型，3株(11.11%)为O18型，2株(7.41%)为O117型，5株(18.52%)未能定型。

2.4　F1菌毛的引物特异性

以引物F1-F和F1-R建立的PCR，可从F1＋大肠埃希菌C600株、C1253-77株、C121v-77株扩增到约为420 bp的片段，与预期的长度大小相当(图1)，而从其他F1－大肠埃希菌中均未扩增到相应的片段，表明引物F1-F、F1-R可用于特异性鉴定F1＋大肠埃希菌。

M.DNA标准DL 2 000；1.F1＋C600株；2.F1＋C1253-77株；3.F1＋C121v-77株；4.P＋C1976-79株；5.F1－K88＋、K99＋、987P＋、F41＋混合物

M.DNA Marker DL 2 000；1-3. PCR product of F1＋E.colistrains C600，C1253-77 and C121v-77 respectively；4.PCR product of P＋E.colistrains C1976-79；5.PCR products of mixed F1－E.colistrains ( K88＋，K99＋，987P＋and F41＋)

图1　检测F1菌毛基因引物的特异性验证

Fig.1　Specificities of the primers for detection of the F1 fimbrialgenes

2.5　P菌毛引物的特异性

以引物irp-F和irp-R建立的PCR，可从HPI＋大肠埃希菌S452621株、S433014株扩增到约为280 bp的片段，与期望的长度大小相当(图2)，而从其他HPI－大肠埃希菌中均未扩增到相应的片段，表明引物irp-F、irp-R可用于特异性鉴定HPI＋大肠埃希菌。

M.DNA标准DL 2 000；1.HPI＋大肠埃希菌(S452621株)；2.HPI＋大肠埃希菌(S433014株)；3.F1＋大肠埃希菌(C1253-77株、C121v-77株)与P＋大肠埃希菌(C1976-79株)混合物；4.HPI－大肠埃希菌(S442712株)

M.DNA Marker DL 2 000；1-2.PCR products of F1＋E.colistrains S452621 and S433014，respectively；3. PCR product of mixed F1＋E.colistrains (C1253-77，C121v-77) and P＋E.colistrains (C1976-79)；4.PCR productof HPI－E.colistrain (S442712)

图2　检测HPI基因引物的特异性验证

Fig.2　Specificities of the primers for detection of the HPIgenes

2.6　分离菌株F1和HPI的PCR检测

利用建立的PCR对27株鹅源大肠埃希菌F1菌毛和毒力岛HPI的PCR检测，结果发现24株(88.89%)为F1＋大肠埃希菌，7株(25.93%)为HPI＋大肠埃希菌(其中4株为F1＋)。通过与O抗原对照比较后，未发现F1菌毛以及毒力岛HPI与O抗原型之间存在相关性。

2.7　药敏试验结果

结果表明所有菌株对头孢唑林和呋喃妥因敏感，74.1%菌株对庆大霉素敏感，51.9%菌株对环丙沙星50%敏感，对多黏菌素、四环素、林可霉素均100%耐药。100%菌株为三重耐药，25.9%菌株为四重耐药，25.9%菌株为五重耐药。

3　讨论

大肠埃希菌感染雏鹅可导致肠炎、浆膜炎、气囊炎以及败血症等，是影响养鹅业发展的重要疾病。本试验从江苏扬州地区2008年3月份～4月份采集的病料分离到31株能在麦康凯琼脂上生长的细菌，通过生化试验证明了其中27株均为大肠埃希菌，并对其抗原性、毒力因子以及耐药性进行检测与分析，对防治该地区鹅大肠埃希菌病有着重要的价值。

O抗原型检测是临床检测大肠埃希菌最常见的项目，本试验揭示了该地区的O抗原型主要有O26、O78、O1、O18以及O117等；但值得注意的是O抗原并不能反映相应细菌的致病性，而毒力因子的检测是临床确定致病性大肠埃希菌最常用的指标之一。为确定鹅大肠埃希菌的菌毛类型，试验利用PCR对所有菌株进行了检测，确定了其中24株为F1＋大肠埃希菌，揭示了F1菌毛是鹅大肠埃希菌最常见的毒力因子。另外，HPI是最早发现于耶尔森菌属的毒力岛，并与该属菌的小鼠致死表型密切相关。国内外研究表明，HPI毒力岛可在耶尔森菌和大肠埃希菌之间水平传播，与致病性大肠埃希菌的毒力进化密切相关。试验通过PCR检测，确定了27株鹅大肠埃希菌中有7株为HPI＋，这提示在临床研究中HPI＋大肠埃希菌不应该被忽略。

本试验还确定了所分离菌株的敏感性药物。之所以进行药物敏感性试验，是因为在兽医临床滥用抗生素仍然十分普遍。其危害除了增加治疗费用和造成药物不良反应外，最主要的是使细菌的耐药性增强。解决这一问题最常规的方法，就是经常对细菌的药物敏感性进行监测，确定各地区细菌耐药情况与发展趋势，为临床兽医用药提供指导。