摘 要：参照国内外已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7的基因序列及其相关的RT-PCR检测方法设计一对引物，扩增目的片段为535bp。通过对RT-PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验，建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点，可用于PRRSV的检测、流行病学调查等。应用此方法对临床样品进行了检测，阳性检出率达66.7%。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；RT-PCR；建立；应用
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductove and respiratorysyndrome，PRRS)在临床上与其他能引起母猪繁殖障碍疾病(如猪细小病毒病、伪狂犬病、日本乙型脑炎、猪瘟、布鲁菌病、钩端螺旋体病等)及其他仔猪呼吸道症状的疾病有着非常类似的临床症状，不具有特征性。加上各猪场间病猪的临床症状和病理变化差异极大，发生细菌性和病毒性继发感染时更使得临床表现和病理变化复杂化。因此，根据临床症状很难做出确诊，必须结合实验室检测来判断。目前，国内外已经建立的实验室检测方法有病毒分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验、间接免疫荧光试验、血清病毒中和试验、乳胶凝集试验、ELISA等。前4种检测方法耗时长，而ELISA方法只能检测PRRSV抗体，对免疫猪群检测不能反映真实的感染情况。
参考国内外学者在PRRSV分子生物学研究方面的进展，本研究拟建立针对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的RT-PCR诊断技术，为兽医临床提供一种快速、准确的PRRS诊断方法，也为基层开展大规模流行病学调查与疫情监测提供技术依据。
1 材料与方法
1.1 病料及参考毒株
病料来自河南省郑州等地具有PRRS临床症状和病理变化的病、死猪的脾脏、血液和淋巴结；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等参考毒株均由西北农林科技大学畜禽重大疫病防治与畜产品安全实验室提供。
1.2 主要试剂
pMD18-T Vector购自大连TaKaRa公司；大肠埃希菌DH5α由本实验室保存；TrizolReagent购自Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶及核酸电泳标准分子质量DL 2 000，均购自宝生物工程(大连)有限公司；RevertAid?First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。其余试剂均为国产或进口分析纯。
1.3 病料的处理
取病猪的肺脏、脾脏和淋巴结等组织1.0 g～2.0 g，剪碎，加少量灭菌PBS(含青、链霉素100单位/mL，pH7.2)用无菌研磨器研磨至糊状，再用PBS按1∶4的体积比稀释成乳剂，－20 ℃反复冻融3次，于4 ℃以10 000r/min离心10 min，取上清，－70 ℃保存备用。
1.4 引物的设计
参照GenBank PRRSV的全基因序列中的ORF7末端序列设计了一对特异性的引物P1/P2。PRRSV-P1：TCT GGCCCC TGC CCA CCA CG；PRRSV-P2：CGG ATC AGG CGC ACA GTATG引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.5 总RNA的提取及cDNA的制备
病毒RNA的提取方法参照Trizol Reagent的说明书进行。cDNA的制备按照RevertAid? First StrandcDNA Synthesis Kit进行。
1.6 PCR扩增
以反转录产物cDNA为模板，用上游引物/下游引物(P1/ P2)扩增目的基因片段，反应体系为10×buffer(含MgCl2)5.0 μL；dNTPs(10 mmol/L) 4.0 μL；上游引物/下游引物/(25 pmol/L)各1.0 μL；rTaqDNA ploymerase 0.5 μL；cDNA 4.0 μL；ddH2O 35 μL。混匀后置PCR扩增仪中，扩增条件为95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min,56 ℃1 min，72 ℃ 1 min35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存备用。
1.7 RT-PCR的特异性、敏感性、重复性试验
1.7.1 特异性试验 同样方法对PRV、PCV-2、CSFV细胞毒进行RT-PCR或PCR操作，验证该方法的特异性。
1.7.2 敏感性试验 将250 μL提取的PRRSV细胞毒，模板依次作1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10000倍稀释，用下游引物P2反转录后，按上述方法进行PCR，验证其敏感性。
1.7.3 重复性试验 将提取的PRRSV阳性细胞毒RNA反转录后在相同条件下，重复进行5次以上RT-PCR检测，以验证该方法的重复性。
1.8 本试验建立的RT-PCR方法的应用
用本试验建立的RT-PCR方法经过对扩增条件进行优化后，对来自河南地区具有一定的PRRS临床症状和病理变化的病料进行RT-PCR进行检测，按1.3的方法处理病料。采用TrizolReagent说明书操作提取RNA，按1.5、1.6的方法进行RT-PCR检测。
2 结果
2.1 RT-PCR扩增
提取PRRSV细胞毒RNA反转录成cDNA后用引物对P1/ P2进行扩增，获得了预计大小一致的535 bp的特异性目的条带(图1)。
M. DNA标准DL 2 000；1.PRRSV的扩增产物
M. DNA Marker DL 2 000；1.Amplified product of PRRSV
图1 PRRSV的RT-PCR扩增结果
Fig.1 The result of RT-PCR amplification of PRRSV
2.2 引物特异性试验
对PRV、PCV-2、CSFV及未接种PRRSV的正常细胞培养液进行PCR操作，电泳检查结果阴性(图2)。
M.DNA标准DL 2000；1.猪伪狂犬病病毒；2.猪繁殖与呼吸综合征病毒；3.猪圆环病毒2型；4.猪瘟病毒
M.DNA Marker DL 2 000；1.PRV；2.PRRSV；3.PCV-2；4.CSFV
图2 RT-PCR特异性扩增结果
Fig.2 RT-PCR specific amplification results
2.3 引物敏感性试验
用RT-PCR方法扩增cDNA模板和稀释模板1∶10、1∶100、1∶1 000均出现明显的目的条带(图3)。而稀释模板1∶10000扩增条带则不清晰。
M.DNA标准DL 2 000；1～5.10－1～10－4倍稀释
M.DNA Marker DL 2 000；1-5.Dilutions with 100,10－1,10－2,10－3and 10－4
图3 PRRSV细胞毒RT-PCR扩增敏感性试验
Fig. 3 Sensitivity assay of PRRSV RT-PCR
2.4 重复性试验
按同样的方法分别将提取的RNA样品在相同条件下，重复5次RT-PCR扩增，结果均能出现相同的检测结果。
2.5 临床样品的检测
用上述建立的RT-PCR方法对河南24份临床样品进行检测，结果有16份样品为PRRSV阳性，另外8份样品为阴性。阳性率为66.7%(图4和图5)。
M.DNA标准DL 2 000；1.阴性对照；2～7.样品
M.DNA Marker DL 2 000；1.Negative control；2-7.Samples
图4 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.4 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products
M.DNA标准DL 2 000；1～9.样品
M.DNA Marker DL 2 000；1-9.Samples
图5 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.5 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products
3 讨论
3.1 RT-PCR方法的特异性
在临床上，PRRSV引起疾病的临诊症状与PRV、PCV-2、CSFV所引起的疾病的临床症状具有相似性，极易混淆，因此必须结合实验室检测来诊断。本研究设计了一对特异性的引物，用RT-PCR方法分别扩出了大约535bp的条带，对PRV、PCV-2、CSFV使用该方法同样进行扩增检测，结果3个参考病毒无任何目的条带检出。表明用设计的引物进行PCR扩增具有良好的特异性。
3.2 RT-PCR方法的敏感性及重复性
RT-PCR技术可对存在于分泌物、组织样品、血液样品、细胞培养物中的病原做出快速检测，结合样品的背景资料(包括发病动物的临床症状、病理变化等信息)，可以在数小时内做出诊断。本研究所建立的RT-PCR方法可以从250 μL滴度为10－1TCID50的PRRSV细胞培养物提取的RNA模板作1∶1000倍稀释仍能扩增出明显的目的条带，检测灵敏度很高。多次重复性试验仍能得到同样的结果。表明本研究所建立的针对PRRSV的RT-PCR快速检测方法具有很好的敏感性和重复性。
3.3 RT-PCR的应用
常见的病原分离鉴定、IFA、IPMA等因需要细胞培养等条件，不能满足基层的实际需要，ELISA方法目前只能检测血清中抗体。另外，猪早期感染PRRSV时抗体水平较低，ELISA不易检出，并且被动免疫和自然感染产生的抗体水平有时难以区分，易被漏诊或误诊。本研究设计的RT-PCR方法具有快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好的特点。用该方法对河南、陕西部分猪场中临床送检的10份疑似为PRRS组织样品进行检测，其中7份样品能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物，阳性率达66.7%。本方法可实现对PRRS的大规模流行病学调查、隐性感染的检测及临床诊断，可在县级以上动物疫病预防控制中心进行推广和应用。
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