猪细小病毒自然弱毒N株VP1基因的扩增与序列分析

摘　要：对猪细小病毒自然弱毒株株基因扩增及测序，利用生物信息学技术预测蛋白的二级结构与细胞抗原表位，以及分析该蛋白的氨基酸差异位点及密码子偏爱性。结果表明，株基因与弱毒参考毒株基因同源性最高，亲缘关系最近。株蛋白的二级结构较为复杂，以折叠为主，并有较多的转角和无规则卷曲区域，在序列的～、～、～、～区域为细胞抗原表位的优势区域。强、弱毒株蛋白存在个氨基酸差异位点，，，，，这些位点处氨基酸残基抗原性与毒力成正相关。株蛋白在、、、、、、、、、、、、和氨基酸于密码子选择上存在一定的偏爱性。关键词：株；基因；扩增；生物信息学分析

猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)引起的导致母猪繁殖障碍的主要传染病之一。该病主要特征为受感染的母猪尤其是初产母猪及血清学阴性经产母猪发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等，而母猪本身无明显临床症状。该病广泛存在于世界各地，呈地方性流行，造成养猪业严重经济损失。目前使用PPV疫苗免疫是预防该病的有效手段。PPV属细小病毒科细小病毒属，是自主复制型病毒，具有独特的分子生物学特性，其VP1、VP2蛋白是主要结构蛋白和抗原相关蛋白，VP3蛋白是由VP2蛋白水解而来。近年来对结构蛋白VP2基因的克隆、测序、序列分析及表达的研究较多，但对VP1基因的研究较少报道。

猪细小病毒N株(PPV-N株)是广西兽医研究所蒋玉雯等从初产母猪死胎脏器分离的PPV自然弱毒株，并将之研制成PPV弱毒疫苗，经实验室及田间试验证明该弱毒苗具有良好的安全性、免疫原性和遗传稳定性。为了进一步研究该弱毒株的自然弱毒分子机理，为今后研制PPV新型疫苗奠定基础，本研究对PPV-N株VP1基因进行了扩增测序及生物信息学分析。

1　材料与方法

材料PPV-N株由广西兽医研究所保存。EZNA Tissue DNA抽提试剂盒为Omega公司产品。TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

引物设计与合成参考GenBank中PPV毒株的全基因组序列(登录号：NC_001718)，设计合成两对引物，分VPa、VPb2段扩增PPV-N株的VP1基因(表1)。

株的提取采取病毒同步接种法增殖PPV-N株病毒，于细胞单层出现病变即倾去培养液，用胰酶消化，离心收集细胞沉淀，按EZNATissue DNA抽提试剂盒说明书抽提PPV-N株复制型DNA(RF-DNA)，－20 ℃保存备用。

扩增基因VPa的扩增条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,35个循环；72℃ 10 min，4 ℃保存。VPb的扩增条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min,72 ℃ 2min,35个循环；72 ℃10 min，10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

表1　扩增PPV-N株的VP1基因的引物

Table 1　Theprimers foramplification of VP1 gene of PPV-N strain

序列测定与分析将阳性扩增产物送生物公司进行纯化、测序并拼接成编码PPV-N株VP1蛋白的基因序列(PPV-NVP1.seq)，并进行序列分析。

基因同源性及遗传进化树分析将PPV-N株VP1蛋白的基因序列(PPV-NVP1.seq)与GenBank数据库上发布的5个PPV参考毒株相应的VP1蛋白的基因序列，应用DNAStar软件的MegAlign程序的Clustal W方法进行多序列比对分析。所用的5个PPV参考毒株分别为中国湖北株(ChinaHB)-AY583318(GenBank登录号)；中国四川株(China SC)-DQ675456<,/SPAN>；加拿大株1(Canada1)-PPU44978，属PPV强毒Kresse株；加拿大株2(Canada2)-NC_001718，属PPV弱毒NADL-2株；西班牙株(Spain)-D00623，属PPV弱毒NADL-2株。

株蛋白二级结构与细胞抗原表位预测用DNAStar软件的Protean程序对PPV-N株的VP1蛋白进行二级结构和B细胞抗原表位的预测。其中，用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法来预测蛋白质的二级结构，用Karplus-Schultz法预测蛋白质骨架区的柔韧性，用Kyte-Doolittle法预测蛋白质的疏水区和亲水区，用Emini法预测特定区域位于蛋白质表面的可能性，用Jameson-Wolf法预测蛋白的抗原指数。

株与强弱毒株的蛋白差异性分析将PPV-N株与PPV强毒Kresse株(Canada1株)、弱毒NADL-2株(Canada2株)的VP1蛋白氨基酸序列，应用DNA Star软件的MegAlign程序的Clustal W方法进行多序列比对分析，然后用DNAStar软件的Protean程序的Jameson-Wolf法进行VP1蛋白氨基酸的抗原指数的预测。

株基因的密码子偏爱性分析将PPV-N株VP1基因递交到EMBOSS(The European Molecular BiologyOpen SoftwareSuit)(http：//genopole.toulouse.inra.fr/apps/emboss)，运行CHIPS(CodonHeterozygosity in a Protein-coding Sequence)程序和CUSP(Create a codonusage table)程序，在线进行密码子偏爱性的计算。EMBOSS的CHIPS程序计算要分析的基因序列，得到一个Nc(Effective number ofcodons)值，该值是一个基因的密码子使用频率与同义密码子平均使用频率偏差的量化值。Nc值的范围为20(每个氨基酸只使用1个密码子的极端情况)到61(各个密码子均被平均使用)。根据Nc值分析其密码子的使用情况，然后运行EMBOSS的CUSP程序，就可得到密码子使用频率表。

2　结果

扩增与测序分析由引物VPa1/VPa2 PCR扩增可得到1 191 bp的VPa产物(图1)，由引物VPb1/VPb2PCR扩增可得到1 481 bp的VPb产物(图2)。

扩增产物VPa和VPb由生物公司测序，将其拼接后得到编码PPV-N株VP1蛋白的基因序列(PPV-N VP1.seq)大小为2 190bp，编码729个aa，GenBank登录号为EF212027。

基因同源性及遗传进化分析PPV-N株VP1基因与5个PPV参考毒株VP1基因的核苷酸序列比对同源性为98.4%～99.9%，推导的氨基酸序列同源性为98.9%～99.6%，PPVVP1基因变异很小。

根据多序列比对结果绘制PPV VP1基因的遗传进化树(图3)，PPV-N株与加拿大NADL-2株的遗传距离最近。

M.DNA标准DL 2 000；A.引物VPa1＋VPa2 PCR扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000；A.Product amplified by primers VPa1 an d VPa2

图1　引物VPa1/VPa2 PCR扩增产物电泳结果

Fig.1　Electrophoresis result of product amplified by primers VPa1and VPa2

M.DNA标准DL 2 000；A.引物VPb1＋VPb2 PCR扩增产物

M.DNA Marker DL 2 000；A.Products amplified by primers VPb1 an d VPb2

图2　引物VPb1/VPb2 PCR扩增产物电泳结果

Fig.2　Electrophoresis result of product amplified by primersVPb1and VPb2

图3　VP1基因序列的遗传进化树

Fig.3　Phylogenetic tree of PPV VP1 genesequences　株蛋白二级结构与细胞抗原表位预测VP1蛋白二级结构预测结果显示，PPV-N株VP1蛋白二级结构以β-折叠为主，并有60个以上的转角和无规则卷曲区域，提示PPV-N株VP1蛋白有较为复杂的二级结构。B细胞抗原表位预测结果显示PPV-N株VP1蛋白的N端的20～56(aa)、61～80、86～130、136～188区域存在优势抗原表位的可能性最大。

株与强弱毒株的蛋白差异性分析通过多条氨基酸序列比对分析发现，PPV-N株与PPV强毒Kresse株(Canada1株)、弱毒NADL-2株(Canada2株)的VP1蛋白氨基酸序列存在7个氨基酸差异位点(T-195-S，E-294-A，T-365-I，G-528-D，Q-533-H，P-586-S，K-715-R)，其中5个氨基酸差异位点(T-365-I，G-528-D，Q-533-H，P-586-S，K-715-R)为PPV强、弱毒株VP1蛋白所特有的差异位点。而且在这5个差异位点处，PPV强毒Kresse株的氨基酸残基的抗原指数(antigenicindex，AI)值均比PPV弱毒NADL-2株、PPV-N株的要高，故可知在这5个差异位点处，氨基酸抗原性与毒力成正相关。推测这5个位点的氨基酸残基的差异为PPV毒株的毒力强弱的决定因素之一。

株基因的密码子偏爱性分析通过EMBOSS的CHIPS程序计算PPV-N株VP1基因序列，得到Nc值为36.592。根据Nc值分析PPV-N株VP1基因密码子的使用情况，然后运行EMBOSS的CUSP程序，就可得到密码子使用频率表。表中的Fract表示各个密码子在编码该氨基酸的密码子中所占的比例(各比例相加总和＝1)，1/1000表示该密码子在编码基因总密码子出现的频率。

通过Fract值和Frequency值的比较分析发现，PPV-N株VP1基因有5个密码子出现的频率为0，其中氨基酸密码子偏爱性为A偏爱GCA，C偏爱TGT，E偏爱GAA，G偏爱GGA，H偏爱CAC，I偏爱ATA，K偏爱AAA，L偏爱CTA，N偏爱AAT，P偏爱CCA，Q偏爱CAA，R偏爱AGA，S偏爱TCA，T偏爱ACA，V偏爱GTA，Y偏爱TAC。

3　讨论

PPV-N株具有优良的生物学特性，是制备预防PPV感染的理想弱毒疫苗株，也是目前国内惟一的PPV自然弱毒疫苗，具有开发应用前景。VP1是PPV主要的结构蛋白和免疫原性抗原，对PPV-N株VP1蛋白基因进行扩增测序和生物信息学分析，有助于研究PPV-N株的自然弱毒的分子机理，丰富其分子生物学资料，也可为PPV分子免疫学和反向疫苗学等研究提供有益借鉴。

本试验设计了两对引物，采用两步扩增法扩增目的片段，可以降低长片段PCR扩增的难度，使扩增易于成功。同时较短片段的扩增可减少PCR扩增碱基错配的几率，确保基因测序的准确性，这为PPV的VP1基因扩增提供借鉴。

PPV-N株VP1基因与GenBank上登录的不同国家地区、不同年度(1996年－2006年)和不同毒力的6个PPV参考毒株VP1基因比对的核苷酸序列同源性为99.9%～98.4%，推导的氨基酸序列同源性为98.9%～99.6%，提示PPVVP1基因较为保守，这与Ranz A I等的研究结果相一致。经序列比对，推测G-584-C，C-881-A，A-1583-G，C-1599-A，C-2115-A，G-2144-A这6个核苷酸位点是PPVVP1基因高变位点。

PPV-N株与加拿大弱毒株NADL-2株的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性均为最高，经遗传进化系谱树分析两者的亲缘关系最近，推测PPV-N株与加拿大弱毒株NADL-2株一样，同属于PPV弱毒株，这就为PPV-N株的毒力和致病性判断提供了分子生物学依据，这个推测与之前对PPV-N株的生物学、免疫学特性与田间试验等一系列的研究结果是一致的。然而，同属PPV弱毒株的西班牙NADL-2株VP1基因在开始编码区域较其他比对序列有显著差异，在其nt1～84处共有63个核苷酸的不连续插入序列，在其nt108缺失1个A，nt 113处缺失1个A，nt116处缺失1个C。这就造成了西班牙和加拿大的PPV参考毒株虽然同为NADL-2株，但两者的同源性较低，核苷酸序列同源性为98.4%，推导的氨基酸序列同源性为98.6%，而且遗传进化系谱树两者的遗传距离最远，分属两个不同的分支，这种现象有待深入研究阐述。

蛋白质的二级结构对蛋白质的B细胞抗原表位有较大影响。蛋白质的二级结构中，α-螺旋、β-折叠的化学键能较高，能较牢固地维持蛋白的高级结构，结构规则稳定不易形变，常处于蛋白质内部，较难嵌和抗体，一般不宜作为抗原表位；而蛋白质的转角及无规则卷曲等二级结构的结构较松散，易于扭曲、盘旋、形变并展示在蛋白的表面，具有一定的柔韧性便于抗原与抗原受体或抗体相互嵌合，因此该区域成为B细胞抗原表位可能性较大。Jameson B A等提出一种综合方案来预测蛋白的抗原性，方案中各因素的权重分配为：蛋白质二级结构占40%，亲水性占30%，表面可及性占15%，柔韧性占15%。该方案所预测的抗原指数越高则该蛋白区域的抗原性越强，构成蛋白抗原表位的可能性越大。对PPV-N株的VP1蛋白的二级结构及潜在的B细胞抗原表位进行了预测和分析，结果表明该蛋白以β-折叠为主，并有较多的转角和无规则卷曲，因此该蛋白的二级结构较复杂。在PPV-N株N端的20～56、61～80、86～130、136～188aa区域含有较多的转角结构，其亲水性和呈现在蛋白表面的可能性较大，该区域的抗原指数也较大，经综合几项预测指标推测这些区域作为优势抗原表位的可能性最大，但最后确证仍需试验来证实。

通过多序列比对分析发现，PPV强、弱毒株VP1蛋白存在5个氨基酸差异位点(T-365-I，G-528-D，Q-533-H，P-586-S，K-715-R)，通过Jameson-Wolf法对该5个氨基酸差异位点的抗原指数进行预测，发现差异位点处氨基酸抗原性与毒力成正相关，可以推测这5个位点的氨基酸残基的差异是PPV毒力强弱的决定因素之一。BergeronJ等研究还发现PPV衣壳蛋白对PPV的亲嗜性具有极大的影响，而病毒的亲嗜性与其毒力的强弱又有着极为密切的关系。在这5个氨基酸差异位点处，PPV强毒的抗原性比PPV弱毒的抗原性强，这可能会使PPV强毒比PPV弱毒对宿主细胞的亲嗜性要强，从而使PPV强毒的毒力强于PPV弱毒。

对PPV的蛋白质功能研究是揭示PPV致病机理和进行PPV基因工程疫苗研究的基础，而要研究蛋白质功能，首先要将其在体外表达出来，因此选择合适的表达载体对于基因表达具有重要的意义。通过EMBOSS的CHIPS程序计算PPV-N株VP1基因序列得到Nc值为36.592，提示PPV-N株VP1基因在密码子的选择上在A、C、E、G、H、I、K、N、Q、R、S、T、V和Y氨基酸存在一定偏爱性。密码子是联系基因的核苷酸序列与蛋白质的氨基酸序列的桥梁，3个核苷酸最终可翻译成一个氨基酸。不同生物蛋白的密码子偏爱性存在着差异，因此不同的外源基因在宿主表达系统的表达就存在着差异。选择密码子偏爱性相近的体外表达载体(如大肠埃希菌、酵母菌、人等)可以更适合病毒蛋白的表达，同时通过改变密码子也可以提高表达量，这为选择合适的PPV-N株VP1蛋白表达系统有一定参考价值。