DNA疫苗与多糖类免疫促进剂在对虾疾病控制上的应用研究进展

摘　要：DNA疫苗作为第3代疫苗具有许多优点，其在水产养殖领域的应用前景广阔。多糖类免疫促进剂是一种能直接作用于免疫系统激活有关细胞的物质，它能够提高机体的免疫力，在虾的养殖领域中已得到应用。论文对DNA疫苗与多糖类免疫促进剂做了简要介绍，并对其在对虾疾病控制上的应用前景进行了展望。

关键词：DNA疫苗；多糖；免疫促进剂；对虾；疾病控制

随着水产养殖业的快速发展，一些养殖品种的病害亦严重起来，如20世纪80年代后期淡水养殖鱼类发生的细菌性败血症，在短短的几年内就蔓延到全国近20个省市，每年造成的经济损失达数亿元。1993年4月～6月我国大陆沿海地区从南到北大面积虾池的虾发病，绝产的占50%以上。台湾省在1987年也曾经发生大规模虾病，使台湾的虾业养殖遭受了致命的打击。这些数字已足以说明防治水产动物疾病的重要性。运用DNA疫苗与多糖类免疫促进剂等方法在虾的疾病防控上取得了较好的效果。

1　DNA疫苗在对虾疾病防治中的研究应用

1.1　DNA疫苗在虾养殖领域的研究

由于虾不存在免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫反应，因而不能像脊椎动物那样通过接种达到自我保护的目的。由于虾的防御系统具有非特异性免疫，适当的诱导可以提高血细胞及多种免疫因子的数量和活性，从而达到识别非己物质，抵抗病原体侵袭的目的。国内外已有很多实验室采用将一部分病毒的功能性基因通过pVAX1或pcDNA3.1载体，以肌肉注射的方式注射到虾体内，从而在体内表达出蛋白，取得了很好的试验效果。如RajeshKumarS等通过在虾体内转入重组的质粒载体从而编码转录出包膜蛋白对抗WSSV，及通过浸泡或是口服的方法作用于养殖虾，从而提高对虾的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、凝集素等各种体液免疫因子的数量，达到增加其本身免疫力的作用。

1.2　DNA疫苗在对虾等水产养殖动物疾病控制上的应用研究

在水产养殖领域中，DNA疫苗的使用以注射法、基因枪法为主，其他免疫方法如浸泡法和口服法，能与注射法相互补充，但目前这方面的研究不多，因此还有待于进一步的探索，以找到操作方便、广泛使用的免疫途径。

1.2.1　注射法　注射法是导入疫苗DNA简便有效的方法，一般用注射器直接将裸DNA盐溶液注入虾肌肉细胞，即可达到免疫效果。目前认为肌肉是较有效摄取外源基因并表达抗原蛋白的组织，因为肌细胞具有多核的特点。这一特定的内环境可能是使肌肉细胞对所摄入的外源DNA的表达具有更大的持久性以及使表达更为持续稳定的重要原因。RajeshKumarS等通过注射法将VP28基因导入虾体内，表达出的抗原蛋白直接与病毒受体结合从而起到免疫阻断剂的作用，达到防控WSSV的目的。

1.2.2　基因枪法　它是将包被的质粒DNA导入靶器官、组织或细胞内，它可以将疫苗DNA导入动物体的各个部位，包括皮下和黏膜。基因枪法使用剂量小、作用明显，能更有效激发机体的免疫应答尤其是细胞免疫应答的能力，是用作基因免疫的最常见最有效的转移方法，ChiarriG等用基因枪将外包DNA金粒子通过氨气喷射鱼体，开发了将DNA导入鱼体细胞内乃至细胞核内的方法，成功地向虹鳟导入外源基因，免疫化学分析表明，基因枪免疫的虹鳟外源基因在表皮、真皮和肌肉组织中均有表达。

1.2.3　口服和浸泡法　AlonsoF等用脂质体包埋的方法把编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因构建到质粒pQBI25CMV启动子的下游，再以质粒DNA浸泡免疫0.2g～0.5 g的虹鳟15 min～30 min，2 d～3 d后发现虹鳟尾鳍处有大量直径10 μm～20μm的荧光斑点，而且除尾鳍外，其他部位如腹鳍、背鳍都可检测到荧光，且该蛋白在体内至少存在10d以上，表明浸泡免疫接种的方法是可行的。不过该试验所用浸泡液中DNA疫苗的含量较高，且需脂质体包埋，因而成本较高，应用受到限制。而以含有编码VHSV糖蛋白基因的质粒浸泡鲑鱼鱼苗，同时使用超声波处理，发现短脉冲低强度超声能增强其体液免疫反应，提高攻毒后的存活率，从而为个体较小的鱼类施行疫苗接种提供了一条可行的方法。

2　多糖类免疫促进剂的使用

免疫促进剂是一种直接作用于免疫系统激活有关细胞系统，以提高机体免疫力的物质，在虾的养殖中已得到广泛应用。多糖类免疫促进剂包括葡聚糖、角素、壳聚糖、香菇多糖和裂褶菌多糖等，都已被证实具有增强免疫效果。但免疫促进剂的应用中存在着效果不持久、过量使用、影响虾体性激素的分泌等问题。

2.1　多糖类免疫促进剂的种类

2.1.1　葡聚糖　葡聚糖能够激发非特异性免疫反应，它主要来自于细胞壁，包括β-1,3-葡聚糖和β-1，6-葡聚糖。β-葡聚糖是一种天然的产物，应用过程中不会产生药物残留，也不会对环境产生污染，因此在水产养殖业上具有很好的应用前景。β-葡聚糖能显著增强虾类的免疫力。汪小锋等的研究表明，经β-葡聚糖刺激后，中国对虾总血细胞的数量增多了83.4%，同时，酚氧化酶的产量提高了81.3%。此外，SuphantharikaM等也观察到，用酵母β-葡聚糖对虎虾分别进行体内和体外刺激以后，能显著增强血淋巴的酚氧化酶活性。Chang CF等报道，如果在饲料中添加适量的β-葡聚糖，再饲喂草虾，则所测得的各种免疫指标，如酚氧化酶活性、超氧化物歧化酶活性都会得到显著改善。上述研究证实了β-葡聚糖对于虾类的免疫增强作用。

2.1.2　几丁质和壳聚糖　几丁质是自然界中最丰富的多糖类物质，它是构成甲壳类动物和昆虫外骨骼和真菌细胞壁的主要物质。壳聚糖则是由几丁质经脱乙酰作用而制得的一种多糖类物质。这两种物质对于鱼类和甲壳类动物都有免疫增强作用。以浸泡和注射的方式，用几丁质和壳聚糖对虹鳟鱼进行处理，可观察到免疫增强效果。如果分别用几丁质和壳聚糖对白对虾进行注射，当几丁质的注射量为6μg/g，壳聚糖注射量低于或等于4μg/g时，对白对虾能有最好的免疫增强效果，几丁质和壳聚糖外，香菇多糖和裂褶菌多糖，都已被证实具有免疫增强效果。

2.2　多糖类免疫促进剂的使用方法

许多报道认为，采用注射的方法可以有效增强白细胞的功能来抵抗病原菌，但是这种方法费时费力，而且不适用于个体较小的虾类，因此，其他方法如口服、浸泡就具有更好的应用价值。口服法不会对水产动物产生应激，也适用于体形较小的动物。汪小锋等在饲料中添加一定量的β-葡聚糖、脂多糖、灭活哈维氏弧菌和灭活鳗弧菌，并饲喂中国对虾后，发现总血细胞的数量增加值最高可达111.3%。浸泡法也有相类似的效果。但无论是口服法，还是浸泡法也都有缺点，如口服法由于消化道中各种消化酶的作用，免疫促进效果会受到一定的影响，而浸泡法所需的量受到水体大小影响，往往需要大量的多糖类免疫促进剂，但能被利用的往往只是很小的一部分。因此，在实际操作过程中，必须对各种影响因素进行综合评价之后，再确定最适宜的使用方法。

3　DNA疫苗与多糖类免疫促进剂在虾养殖应用中存在的问题

DNA疫苗有许多优越性，但作为一种新型的疫苗，DNA疫苗还有些不完善的地方，在实际应用中也有些问题有待解决。如DNA疫苗的安全性，构建疫苗的DNA是否会可能整合到宿主DNA细胞的染色体上，从而造成插入突变；在生产实践中，不可能对每只对虾进行肌肉注射或是大规模采用口服或浸泡，因为虾的吸收率以及疫苗的经济因素都需要考虑。而多糖类免疫促进剂对水产动物进行处理时，如果是进行长期处理，那么就有可能会失效，甚至有时会产生副作用。多糖类免疫促进剂作为免疫促进剂的一种，在对虾类疾病防治过程中，也有同样的规律。导致这种现象的生理机制尚不明了，但有可能是由与免疫促进剂有关的负反馈系统引起的，它能使免疫系统恢复到先前的状态。因此，在使用免疫促进剂时，必须首先探明这种免疫促进剂的有效作用期限。免疫促进剂的过量使用也是一个问题，这时免疫增强效果是不理想的，反而会有一些副作用。另外，在虾的生活史中，成熟期和产卵期是非常重要的时候，但是很少有研究涉足到这一领域。产卵期中，虾体会分泌一些激素，使得免疫系统抵抗力下降。免疫促进剂能够抑制这种下降，但是会影响到激素的分泌，进而影响虾的产卵。

4　结语

今后应从以下方面进行研究。①DNA疫苗与免疫促进剂的最佳使用方法，根据情况选择注射，浸泡还是口服。②DNA疫苗与多糖类免疫促进剂的有效性研究。③DNA疫苗和多糖类免疫佐剂的联合使用。