摘 要：以灭活的检测用抗原为材料，抽提灭活小反刍兽疫病毒的基因组RNA作为模板，根据参考文献及GenBank下载的序列，设计3对位于F基因的引物(2对为套式引物)，进行RT-PCR扩增及扩增片段的T载体克隆、序列分析。结果显示，所设计引物单独或套式RT-PCR对模板均有预期大小的片段扩增；扩增片段经核苷酸序列测定和分析，表明所扩增片段为小反刍兽疫病毒的F基因片段。且所设计引物对同属牛瘟病毒、犬瘟热病毒无扩增，证明所用引物为小反刍兽疫病毒特异性引物，此3对引物可用于小反刍兽疫与牛瘟等同属病毒的鉴别诊断。
关键词：小反刍兽疫病毒；F基因；RT-PCR；鉴别诊断
小反刍兽疫病毒(Pest des petits ruminantsvirus，PPRV)是副黏病毒科麻疹病毒属成员，主要感染山羊、绵羊等小反刍兽，野生羚羊等也有感染的报道。临床症状包括高热，眼鼻分泌物增多，肺炎，腹泻等。感染率和病死率分别可高达100%和90%。小反刍兽疫最早于1940年在西非报道，现在主要存在于非洲、中东、阿拉伯半岛和南亚地区。与我国临近的印度、土耳其、巴基斯坦等国家均存在小反刍兽疫，2007年7月我国西藏边境地区经印度传入此病，但已将该病控制、消灭于局部。小反刍兽疫病毒和同属的牛瘟病毒，在血清检测中具有共同的抗原，中和试验也有一定程度的交叉反应，因此二者极易混淆。
检测小反刍兽疫病毒常用的方法有病毒分离、中和试验、竞争ELISA、RT-PCR、测序及RT-PCR/ELISA等方法，其中前三者较费时，并且需要活病毒的存在，后二者虽然方法较敏感，但价格较昂贵也费时；只有RT-PCR的方法快速、简便、价格较低，而其中的套式PCR准确度也较高，只要设计合适特异的引物就可对PPRV和牛瘟病毒(RPV)进行有效的鉴别诊断。农业部热带亚热带动物病毒学病重点开放实验室根据参考文献和GenBank下载的PPRV相关序列设计3对F基因的引物，以PPRV灭活抗原为材料，同时扩增RPV和犬瘟热病毒(CDV)，来检测引物的有效性和特异性；同时对扩增的DNA产物进行序列测定，以最后确定序列正确与否。现将整个试验报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料、菌种和测序载体
农业部热带亚热带动物病毒学病重点开放实验室购买的PPRV检测用试剂盒(BDSL competitive ELISAKit)PPRV抗原为抽提病毒RNA的材料；牛瘟RNA抽提自牛瘟弱毒疫苗，犬瘟热RNA抽提自农业部热带亚热带动物病毒学病重点开放实验室确诊的临床病料；所用的菌种为农业部热带亚热带动物病毒学病重点开放实验室保存的DH5α菌；测序载体为pMD18-TVector，购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 酶和其他试剂
RNA PCRKit及PremixTaq酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；Trizol试剂、胶回收试剂盒及小量柱式质粒纯化试剂盒，均购自上海华舜公司。氯仿、异丙醇等其他试剂均为分析纯试剂。
1.3 引物
根据参考文献和GenBank下载的序列设计下列3对扩增F基因的引物：
F1：5′ATCACAGTGTTAAAGCCTGTAGAGG 3′
F2：5′GAGACTGAGTTTGTGACCTACAAGC 3′
F1A：5′ATGCYCTGTCAGTGATAACC 3′
F2A：5′\"YTATGRACAGARGGGACAAG 3′
F3：5′ATAAAGGCCCGGGTMACA 3′
F4：5′AGGTACCCCTTTAACAGT 3′
注：Y＝C＋T；R＝A＋G；M＝A＋C。
其中F1和F2为一对F基因ORF上游外引物，预期扩增片段长度为372 bp；F1A和F2A为一对上游内引物，预期扩增片段长度为310bp；F3和F4为一对F基因ORF下游引物，预期扩增片段长度为681 bp。
1.4 病毒基因组RNA的提取
取200 μL的灭活病毒液或组织研磨液，加1 mL Trizol液，室温放置6 min～10 min后，加200μL氯仿，混匀放置10 min,12 000 r/min离心15 min，轻取上清，加入等体积的异丙醇，置－20℃冰箱沉淀过夜；次日，12 000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀用750 mL/L乙醇洗涤，37 ℃干燥5 min～10min。最后用20 μL水溶解，－20 ℃贮存备用。
1.5 RT-PCR扩增条件的优化
用MJ Mini梯度PCR仪进行梯度PCR和扩增条件的优化。最优扩增条件为：37 ℃ 45 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 1min,50 ℃ 1 min,70 ℃ 2 min，进行30个循环；最后70 ℃ 10 min。产物于15g/L琼脂糖凝胶中电泳，检查扩增情况。
1.6 序列测定和分析
纯化回收RT-PCR产物，与测序载体连接；然后筛选阳性克隆进行序列测定，用DNAsis软件对所测数据进行处理并分析。
2 结果
2.1 RT-PCR扩增结果
所设计的3对引物单独对PPRV均有正确扩增，而对RPV和CDV无扩增，虽然引物F1和F2对RPV有扩增，但片段大小不正确，说明针对小反刍兽疫病毒所设计的引物总体上特异性较好。扩增结果见图1。因受我国无此病例存在的限制，引物对多个样本是否都具有特异性，还需进一步的测定。
M.DNA标准DL 2000；1～3.分别是引物F1-F2、F1A-F2A和F3-F4对PPRV的扩增结果；4～6.分别是引物F1-F2、F1A-F2A和F3-F4对RPV的扩增结果；7～9.分别是引物F1-F2、F1A-F2A和F3-F4对CDV的扩增结果；10～12.分别是引物F1-F2、F1A-F2A和F3-F4的阴性对照
M.DNA Marker DL 2 000；1-3.The fragments of PPRV amplified byprimers F1-F2/F1A-F2A/F3-F4，respectively；4-6.The fragments of RPVamplified by primers F1-F2/F1A-F2A/F3-F4，respectively；7-9.Thefragments of CDV amplified by primersF1-F2/F1A-F2A/F3-F4，respectively；10-12.The negative controls of theprimers F1-F2/F1A-F2A/F3-F4，respectively
图1 三对引物扩增PPRV、RPV及CDV的电泳图
Fig.1
2.2 RT-PCR反应条件的优化
各对引物经梯度PCR来优化反应条件后，得出对3对引物都基本适合的反应条件，先37 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min；然后94 ℃1 min,50 ℃ 1 min,70 ℃ 2 min，进行30个循环；最后70 ℃ 10 min。
2.3 核苷酸序列分析
经核苷酸序列比较，3对引物所扩增片段与
GenBank下载序列X74443(Vaccine Strain Nigeria75/1)F基因相对应位置同源性均为100%(图2和图3)，进一步确证了引物扩增产物的正确性。引物F1和F2、F1A和F2A、F3和F4扩增片段长度分别为372、310、681bp。
图2 引物F1-F2和F1A-F2A扩增DNA产物核苷酸序列与下载序列X74443的比较
Fig.2 Comparisonof nucleotide sequencesof DNA amplified productsbetween primersF1-F2/F1A-F2A and reference X74443
图3 引物F3-F4扩增DNA产物核苷酸序列与下载序列X74443的比较
Fig.3 Comparison of nucleotide sequences of DNA amplified productsbetween primers F3-F4and reference X74443
3 讨论
3.1 PPR的鉴别诊断
在用设计引物扩增PPRV时，同时也对同属的RPV、CDV基因组RNA进行了扩增，结果二者对3对引物皆无扩增，从本试验的结果看出，3对引物可初步用于3种病毒的鉴别诊断。但还需大量的样本来进行验证以及引物扩增条件及引物本身序列的优化等。
3.2 小反刍兽疫的监测
2007年以前，我国没有小反刍兽疫流行的记录。2007年7月我国西藏边境地区经印度传入了该病，经有关部门采取彻底扑杀病畜及同舍畜的措施，已将该病消除于局部。但该病仍有从边境地区传入或老疫区再次暴发的可能，所以仍需加强对该病的监测和控制，尤其是边境地区，以防该病蔓延至内陆地区，给全国的畜牧业造成严重的危害。
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