中药活性成分及药理作用研究新方法

摘　要：文章对超临界流体萃取技术、膜分离技术、半仿生提取法、分子蒸馏技术、超微粒粉碎技术、微波辅助萃取、酶法提取等中药活性成分提取分离以及组合化学技术、分子生物色谱、多靶点筛选与高通量药物筛选等中药药理学研究方法进行了综述，旨在为创制现代新型中兽药，提高中兽药质控水平和实现中兽药现代化提供参考。

关键词：中药；活性成分；提取分离；药理

我国目前有2 000多家兽药厂，生产各种中兽药制剂4000余种，但近年来，三类以上的中兽药新产品或新制剂申报和批准的很少。其中最关键的原因是“药效物质基础”研究薄弱，普遍存在化学研究与生物学研究脱节。所以，我国中兽药产品要想在激烈竞争的国际市场中占有一席之地，必须建立活性成分及药理作用研究和质量控制的新方法，这也是中兽药现代化、产业化和国际化的关键。

1　中药活性成分的提取分离

1.1　超临界流体萃取技术

超临界流体(SFE)具有和液体相近的密度，黏度与气体相近，扩散系数为液体10倍～100倍，具有较好渗透性和较强溶解能力。SFE技术的原理是控制超临界流体在高于临界温度和临界压力的条件下从目标物中萃取成分。20世纪70年代，德国学者采用此法从春黄菊中萃取出有效成分，产率高于传统溶剂法。日本学者也先后应用SFE技术从药用植物蛇床子、黄连、苍术、茵陈蒿、桑白皮、甘草和紫草中萃取了有效成分。紫杉醇是来源于红豆杉属树木、对卵巢癌有效的药物，用CO2萃取技术加入乙醇为夹带剂，从短叶红豆杉的根皮中萃取紫杉醇，效果优于乙醇萃取法。单猪屎豆碱是一种有抗肿瘤和抗癌活性的生物碱，美国学者利用此法结合阳离子交换树脂，从植物美丽猪屎豆种子，萃取到纯度为95%以上的单猪屎豆碱。

1.2　膜分离技术

膜分离技术是一种使用半透膜的分离方法，在常温下以膜两侧压力差或电位差为动力，对溶质和溶剂进行分离、浓缩、纯化。膜分离技术主要是采用天然或人工合成高分子薄膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分流质和溶剂进行分离、分级、提纯和富集操作。现已应用的有反渗透、纳滤、超过滤、微孔过滤、透析电渗析、气体分离、渗透蒸发、控制释放、液膜、膜蒸馏膜反应器等技术，其中在药学工业中常用的有微滤、超滤和反渗透3种。优点是可以在原生物体系环境下进行物质分离，有效膜面积大，滤速快，无二次污染，富集产物或滤除杂质效率高，无需加热浓缩，适用于热敏性成分。陈正行采用超滤-纳滤提取脂多糖，原液中的蛋白质等杂质含量降低了85.5%，无机盐也可被去除87.4%。

1.3　半仿生提取法

半仿生提取法(SBE)是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，模拟口服药物经动物胃肠道转运吸收的环境，采用活性成分指导下的导向分离方法，为口服给药制剂设计的一种提取工艺。具有有效成分损失少、成本低、生产周期短的特点。战旗等采用SBE法和水提法(WE)对麻黄的提取液成分含量进行比较，以麻黄总生物碱、麻黄碱、浸膏得率为指标，结果表明SBE法显著优于WE法。孙秀梅等在对甘草进行“饮片颗粒化”研究过程中，以甘草次酸、甘草总黄酮、浸膏量为指标，对SBE法和WE法进行了比较，发现SBE液中甘草总黄酮是WE液的14倍，其他二项指标也均高于WE液。若在提取液中加入拟消化酶活性物质，可使提取过程更接近药物在机体胃肠道的转运吸收过程，更符合辨证施治的中兽医药理论。

1.4　分子蒸馏技术

分子蒸馏是一种在高真空下(残气分子的压力<0.11 Pa)进行的连续蒸馏过程。具有分离程度高、可保护物料稳定、产品耗能少、产品成本低等特点。王发松等用分子蒸馏技术开展了从毛叶木姜子果油中分离纯化柠檬醛的工艺研究，所得柠檬醛的纯度为95%，产率为53%，损失率仅为15%。王发松等利用分子蒸馏技术对干姜油进行分离纯化，结果姜油中的萜类和姜辣素类组分中姜烯酚类化合物的含量达到了86%以上，姜酚的含量达到了60%左右，分离出萜类成分中的姜烯和丁香烯的含量分别达到了55%和20%以上。分子蒸馏技术只适用于液体或适当加温即具流动性的半固体物质的分离纯化，主要用于高沸点、热敏性物料的分离纯化。

1.5　超微粉碎技术

超微粉碎可使药材的细胞壁破碎，能大幅度提高有些成分的释放度和释放量，且粉碎环境温度低，对不耐热和挥发性成分的物品的粉碎尤为适宜。植物源中药的活性成分多为植物的次生代谢产物，贮存于细胞内。当药材颗粒较大时，有效成分要穿过细胞壁才能释放出来，一般粉碎的药材按传统方法提取时，部分有效成分易残留在细胞内而随药渣弃去。采用超微粒粉碎技术可克服上述缺点。超微粉碎技术在中药粉碎中的应用日趋增多，应用该技术，可以将原料药从传统粉碎75μm以上粉末，即200目以下粉末，细化至中心粒径5 μm～10 μm，使原药材细胞的破壁率超过95%。

1.6　微波辅助萃取技术

中药在微波场中，分子发生极化，可将在电磁场中吸收的能量转化为热量，而药材中不同成分具有不同的介电常数，接收微波能量的程度不同。利用中药不同成分吸收微波能力的差异，使中药组织内的某些成分被选择性加热，目标成分从药材中分离进入萃取剂，可显著提高萃取效率。微波辅助萃取是里外同时加热，消除了热梯度，从而使萃取质量大大提高，有效保护了中药活性成分。微波辅助萃取可大大节省时间，如同样的原料用常规方法需2次～3次，而在微波场中可1次提净。此外，微波萃取物纯度高，可水提、醇提、油提，适用广泛。张梦军等用微波辅助萃取法和水提法提取甘草黄酮，用均匀设计法，优化了微波提取甘草黄酮的实验条件，在优化的试验条件下，微波辅助萃取法(24.6mg/g)明显优于水提法(11.4 mg/g)。

1.7　酶法提取

酶法提取的原理是利用酶反应的高度专一性，将细胞壁的组成成分水解或降解，破坏细胞壁，从而提高有效成分的提取率。马桔云等进行了采用酶法从穿心莲中提取穿心莲内酯的试验。在提取之前，加入纤维素酶进行酶解，与原工艺比较，穿心莲内酯提取率大大提高，后经薄层层析检测，两种提取工艺得到的成分没有区别，说明酶的加入不影响所提取的成分。陈哲超等采用复合酶和热水浸提法综合分离纯化香菇中多糖蛋白，与单纯热水提取相比，总氨基酸与必需氨基酸的含量均提高了2倍以上，香菇多糖含量提高了4倍，抗病毒活性的高分子量多糖含量明显提高。酶法提取对试验条件要求较高，为使酶发挥更大作用，需先确定最适温度、底物的浓度、温度、pH、抑制剂和激动剂等。

2　中兽药活性成分药理作用的研究新方法

由于中兽药有效成分的复杂性和药效作用的多样性，中药药理学研究一直是中兽药研发领域的难点和薄弱环节。随着现代药物分离、纯化、检测技术的发展，中兽药在君、臣、佐、使的理论指导下，将中药提取物中的某类成分与药理学研究结合，可更有效地判断中药提取物化学组成与药效作用的相关性。

2.1　单味药研究法

中兽药存在多种药用部位，一种有效部位中有多种药用成分，可利用各种现代筛选模型和筛选技术，发现2种～3种不同作用的有效部位和每种有效部位中的2种～3种有效成分。在有效部位和有效成分2个层次上以一种药理作用为主要因素，研究部位间或成分间或部位与成分间相互促进或相互抑制，可初步阐明中兽药综合治疗作用的机制。用极性由小到大的4种有机溶剂依次萃取当归补血汤水煎液， 所得各部位给饥饿性气虚模型小鼠口服， 以T 淋巴细胞百分数为指标，探讨发挥益气功效的有效部位，结果证明全方益气的药效物质基础主要存在于正丁醇与水层的极性区间，可能主要是黄芪多糖、苷类及当归水溶性物质。

2.2　整方研究法

整方法将复方视为一个整体，探讨复方的组方依据及作用原理，阐释复方组分的配伍规律及治病作用机制。研究中运用植物化学方法对复方的化学成分进行系统分离和鉴定，以获得全方化学信息，结合单味药成分，还可分析整方与单味药的区别，发现提取过程中有无新化合物生成等。如从中药麻醉复方整方中分离获得东莨菪碱，从白头翁汤汤剂中获得生物碱、香豆素、皂苷、柠檬苦素4类化学成分。相对于单味药来说，整方中含有更加复杂的化学成分，因此整方法的工作难度更大、涉及面更广。建立有效系统的生物活性指导分离分析方法将是今后的研究重点。若将整方法与拆方法结合运用，更有助于复方效应物质基础的全面阐释。

2.3　代谢研究法

复方成分在消化道内，一些经肠内菌群代谢转化后被吸收，另一些则以原型被吸收，吸收后的成分在肝脏解毒后经胆汁排泄，与肠内菌接触可发生结合、裂解等代谢转化后再次被吸收。还有些成分不被胃肠吸收而直接排泄。代谢研究法的思路之一是用整体动物进行代谢研究，即通过给药后对动物血液、尿、胆汁、胃液、肠液、粪便等进行分析、分离，从而探讨复方在体内真正发挥药效的成分和作用机理。思路之二是在体外模拟体内条件进行代谢研究，即通过分析复方在人工胃液、肠液及肠道菌丛中可吸收成分及其转化特征，结合药效学的结果分离中药复方有效成分。如大鼠口服参附汤后，乌头类生物碱卡米查林、塔拉胺、附子灵以原型形式被吸收，而人参皂苷则是经肠内细菌代谢后以代谢产物compoundK形式吸收进入体内，且均通过尿液排出体。

2.4　组合化学技术

天然组合化学库理论认为，中兽药复方是根据中兽医理论和实践以及单味药的功能、主治和性味，通过人工组合形成的具有疗效的相对安全的天然组合化学库。该方法是以中兽药复方天然组合化学库的多靶作用机理为依据，在中兽医药理论的指导下，采用反映方剂主治病证的药理学指标，通过组分或单体成分的组合筛选，找出其活性最强的有效组分构件。复方成分是由多种结构类型的组合化学库组成的分子库。多数植物药已分离鉴定出100种左右的化学成分，因此，一个由4味～5味中药组成的复方，就可能含有500种左右的化学成分，且在加工炮制过程中可能还会产生新的成分。通过类似于亲和色谱的方法直接从库中提取有相互作用的化合物，再分别测定各类化合物的结构和生物活性，经过分析和归纳，最终阐明复方作用物质基础。有人采用二元索引库筛选法对川芎、天麻提取物的复方组合化学进行了探索研究，结合血清药理学方法，找出了活性最强的2组构件，即川芎醇提物加天麻醇提物是组合复方抗血小板释放5-羟色胺作用和阻滞血管内皮细胞钙通道作用的基本构件。中药复方的组合化学研究，体现了复方多组分协同的特点。

2.5　分子生物色谱技术

随着现代色谱、光谱及计算机技术的发展，借助仪器分析手段对中兽药复方的物质基础和作用机理进行研究已被普遍采用。这些技术包括液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、毛细管电泳法(CE)、示差折光检测法(RI)、气相色谱法(MS)、核磁共振法(NMR)等。以这些技术为基础，建立中兽药指纹图谱及“智能统一数据库”，结合中医药理论，有助于阐明复方作用的效应物质基础。同时，随着现代分子生物学的发展，体内神经介质、酶、受体在生命活动中的调节作用逐步被揭示，特别是分子生物学与生物医学、药物化学的紧密结合，产生了分子生物色谱技术。与传统的色谱技术利用分子间的物理作用分离化合物不同，该技术是基于生物大分子的特异性识别和相互作用来分离和测定活性化合物。其操作过程是将生物体内活性物质(如酶、受体、运输蛋白和其他具有重要生理功能的生物大分子)固定于色谱填料中，中药复方提取物经过色谱柱后，经过特异识别、结合和分离，最终被分离鉴定。分子生物色谱中药物在柱上的保留行为直接与活性相关，对生理学和药理学研究具有特别意义。分子生物色谱不仅可研究复方效应物质基础，还有助于阐释药物的分布、排泄、代谢、活性、毒副及体内生物转化。如将肝微粒体固载于色谱担体上，可研究中药成分在生物体内可能发生的生物转化。由于分子生物色谱可用粗提液直接进样，简便快速，重现性好，在中药复方物质基础研究中具有巨大的应用潜力。

2.6　多靶点筛选与高通量药物筛选

多靶点筛选的方法就是针对中药复方多成分调节作用的多靶点特性，通过配体-受体的药物研究理论，进行药效物质作用靶点分析或有效成分的确定。利用高通量药物筛选是以自动化的方式进行大量的化合物筛选，以获取能够作用于各种生物分子靶点(如细胞表面受体和细胞内信号传导分子等)的具有生物活性的化合物。通过对种类繁多的合成及天然化合物作针对各种药物靶体的筛选，可从中寻找最佳的化合物，进行新药的开发。其特点是规模大、速度快、成本低、周期短。高通量药物筛选建立多指标的中药成分筛选，大规模药物筛选和计算分析处理已经达到每天可筛选100000个化合物。

2.7　中药血清药理法

中兽药经口给动物灌服一定时间后采集动物血液、分离血清，用此含有药物成分的血清进行体外实验，可深入揭示药物作用机理的优点，又能够防止中药粗制剂本身的理化性质对试验的干扰，反映中药在胃肠道消化吸收、生物转化、产生药理效应的真实过程，并代表了药物在体内产生作用的真正有效成分。丁岗等首次在建立地黄HPLC指纹图谱的基础上研究地黄的血清药物化学，通过比较地黄药材各提取部位、给药与未给药大鼠血清的HPLC指纹图谱，研究地黄的活性成分及其作用机制。结果表明，地黄水溶性部位给药组大鼠血清的HPLC指纹图谱与其他给药组及空白对照组有明显不同。

2.8　中兽药的质控和安全性评价

近年来，随着药物分析、检测与研究新技术的发展，中兽药标准化有了突破性进展。《中国兽药典》(2005)中有关中药质量控制的记载比较全面，已成为中兽药临床应用的参照标准，2005年版药典收录中药及其有效成分的质量标准水平有着大幅度提高。薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱技术，紫外检测法(UV)，红外光谱法(IR)，质谱法(MS)，核磁共振法(NMR)等波谱技术，各种色谱/波谱、指纹图谱及计算机联用技术的发展，这些技术已被广泛应用于中药的质量研究与评价。另外，一些现代科学技术如DNA遗传标记技术、基因芯片技术、扫描电镜、激光共聚焦显微镜等技术用于中药的质量鉴定方面，建立符合中兽药多成分、多靶点协同作用特点、与体内疗效直接相关的质量控制新体系。

近年来，随着医药学研究新技术的出现和应用，中兽药的安全评价体系正在逐步完善。中兽药安全评价中研究的新领域有高通量筛选与基因芯片，可以快速大量筛选药物的有效成分或毒效成分；已在细胞水平上研究药物的毒性作用，采用细胞毒性试验MTT法，可以快速高效地检测药物对细胞增殖的影响及毒性反应。

3　结语

随着化学、生物学及生命科学等相关领域的发展，中药活性成分及药理作用的研究不断引入新的理论、思路、方法和技术。依据传统中兽医药学理论，借鉴现代科学领域的最新技术和方法，加强学科交叉、协调和配合，有可能在中兽药活性成分及药理作用的研究方面取得重大突破，这对阐明与发展中兽医药理论，创制现代新型中兽药，提高中兽药质控水平，实现中兽药现代化均具有重要意义。