黄连解毒散超微细粉中黄芩苷在家兔体内的药代动力学研究

超微粉碎是近年来国际上发展非常迅速的一项新技术，应用这种技术可将固体物料粉碎成直径小于10μm的粉体。粉碎是中药生产和制备各种剂型的基本操作，而超微粉碎的细胞破壁率特别高，大于95%，所以将它应用于中药制剂的制备中，可大幅度地提高药材中有效成分的释放和在体内的吸收，提高中药制剂的生物有效性。故此，不少业内专家认为，超微粉碎技术在中药加工上的应用研究，将带来中药行业的新一轮的技术革命。

黄连解毒汤出自王焘《外台秘要》，本方由黄连、黄柏、黄芩、栀子组成。具有清热泻火解毒之功效，主治一切实热火毒、三焦热盛之证。无论内服、外用具有良好的治疗作用。《中华人民共和国兽药典》（2000年版）中的黄连解毒散即源于本方。据研究，本方具有一定的抗菌、解毒、耐缺氧、抗自由基等作用。在兽医临床上，本方广泛应用于败血症、脓毒血症、痢疾等各种急性炎症。

黄一帆等已对中药方剂黄连解毒散进行普通粉碎和超微粉碎后的粉末形态学进行了比较观察，利用扫描电镜、生物显微镜、激光粒度测定仪对普通粉和超微细粉进行了表征，发现药材经超微粉碎后，粉末颗粒细微均匀，颗粒的球性度提高，复方均质度明显改善，绝大多数细胞破壁。黄芩苷是黄连解毒散黄芩中主要的有效成分，与黄芩的清热解毒，燥湿等功效有十分密切的关系。药理研究表明黄芩苷具有抗菌、抗病毒、降压、保肝、解毒、免疫调节等药理作用，体外溶出度试验表明超微粉碎可提高黄连解毒汤中黄芩苷溶出量。对该方进行超微粉碎后有效成分黄芩苷在体内的药代动力学研究，国内未见报道。本文在此基础上，采用高效液相色谱法测定家兔体内黄芩苷的血药浓度，比较黄连解毒散超微细粉、细粉中黄芩苷在家兔体内的药代动力学参数，以期揭示黄连解毒散经超微粉碎后主要成分在体内的变化规律及其生物利用度，为黄连解毒散超微粉在临床应用提供科学依据。

1．材料和方法

1．1试验动物

10只健康家兔（购自福建医科大学实验动物中心），公母各半，体重2.5～3.0kg。单笼饲养，自由饮水。

1．2 主要试验仪器

美国Agilent公司1100型高效液相色谱仪；HSC-24A型氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）；BMF-6型倍力超微粉碎机（济南倍力粉技术工程有限公司）；FZ-102型植物试样粉粹机（河北黄骅市家务科学仪器厂）；StatoriusBS210S型电子天平（北京塞多利斯天平有限公司）；AL104型电子天平（西德）；TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1．3药材与试剂

黄连解毒散由黄连、黄柏、黄芩和栀子(购于福州市药材采购供应站)按规定比例混合而成。黄连解毒散细粉由植物试样粉碎机粉碎，过65目筛。黄连解毒散超微细粉由济南倍力粉技术工程有限公司采用超微粉碎技术制成。试验前40℃减压干燥至恒重，给药前用蒸馏水配成悬浮液。

黄芩苷标准品（中国药品生物制品检定所，批号10715-200212）；甲醇为色谱纯（江苏汉邦科技有限公司）；磷酸为分析纯（广东光华化学厂有限公司）；肝素钠（上海惠兴生化试剂有限公司）。

1．4 给药与血样采集

10只家兔试验前根据性别、体重随机分为2组，即黄连解毒散细粉组和黄连解毒散超微细粉组，按4g・kg-1剂量灌胃给药，给药前禁食12h，于给药后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6、8、12、24h颈静脉采血2.5mL,肝素钠抗凝。3000r/min，离心15min，分离血浆，分装于eppendorf管中，-20℃保存待测。

1．5 血浆中黄芩苷浓度的测定

1．5．1样品处理

精密吸取各时间点的含药血浆0.2mL于离心管中，加1.4mL甲醇超声振荡15min，旋涡振荡1min，12000r/min离心15min，取上清液到另一干净的离心管，40℃水浴氮气流挥干，残渣加0.25mL流动相溶解，并旋涡振荡2min，超声5min，0.45μm滤膜过滤，最后取20μL进样。

1．5．2标准曲线

精密称取黄芩苷标准品，加流动相配成10μg・mL-1的标准品溶液。精密吸取黄芩苷标准品溶液1mL置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，配制成1μg・mL-1标准品储备溶液精密吸取6、12、24、36、50、100μL黄芩苷标准品溶液（1μg/mL）于离心管中，40℃水浴氮气流挥干，分别加入空白血浆0.2mL，得不同浓度的血浆标准液（浓度分别为0.03 μg/mL、0.06 μg/mL、0.12μg/mL、0.18μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL），按“样品处理”项下方法处理并进样。得到回归方程为：y=39.849x+0.467（r=0.9994）；在0.03～0.5μg/mL之间线性关系良好。以信噪比S/N 为3 计，该方法的检测限为0.02μg・mL-1。

1．5．3回收率的测定

用空白血浆和黄芩苷标准品溶液配制0.03μg/mL、0.18μg/mL、0.5μg/mL黄芩苷血浆样品，每种浓度样品数n=5，按“样品处理”项下方法处理进样分析，测得高 、中、 低 3个浓度水平血浆中黄芩苷的回收率和 RSD分别为75.96％、78.07％、78.85％和4.29％、4.57％、4.38％。

1．5．4精密度的测定

用空白血浆和黄芩苷标准品溶液配制0.025μg/mL、0.15μg/mL、0.4μg/mL黄芩苷血浆样品，每种浓度5份，按“样品处理”项下方法处理，测得高、中、 低 3 个浓度水平血浆中黄芩苷的日内 RSD 分别为4.66 %、3.16%、 4.22% ，日间 RSD 分别为 4.71%、3.90% 、4.68%。

1．5．5色谱条件? 色谱柱为Hanbon 1C18254F（4.6mm×250mm）；流动相为甲醇-水-0.2%磷酸(55：45：0.2)；流速1m1／min；检测波长280nm。 黄芩苷的保留时间为8.4～8.7min。黄芩苷标准品、空白血浆、空白血浆加黄芩苷标准品、家兔灌药血浆样品的色谱图如图1-5。

图1　黄芩苷标准品色谱图

图2　空白血浆色谱图

图3　血浆中黄芩苷标准品的色谱图

图4　家兔灌胃HLJDS 细粉血浆黄芩苷色谱图

图5　家兔灌胃HLJDS超微细粉血浆黄芩苷色谱图

2．结果

2．1家兔口服黄连解毒散后的黄芩苷血药浓度结果见表1，图6。

表1　家兔黄芩苷血药浓度（n=5，μg /mL）

图6　黄芩苷超微细粉和细粉药时曲线图

2．2家兔内服黄连解毒散的药带代动力学参数

将两组给药后不同时间点采血测得的血药浓度时间数据的均值，采用药代动力学软件PKS(Pharmaceutical KineticsSoftware)处理药时数据，主要药代动力学参数见表2。

表2 家兔内服黄连解毒散（4g/kg）后血浆黄芩苷药代动力学参数

3．分析与讨论

由于黄芩苷的结构为5，6二羟基黄酮-7-0葡萄糖醛酸苷，易氧化，须在低温下进行，所以，在用氮气吹干时，采用了较低的水浴温度40℃，而不是常用的50-60℃。黄芩苷极性较大，且有一定的酸性，为了防止其拖尾，加入磷酸抑制其解离，起到改善峰形的作用。何心等用高效液相色谱电化学法测定双黄连中黄芩苷的血药浓度，直接用乙腈沉淀蛋白，在本次试验中，我们发现甲醇超声提取法的回收率比乙腈超声提取法高一倍，说明了用甲醇提取比用乙腈好，这可能是因为中药有效成分的血药浓度都很低，在ng和μg级，因而对提取方法敏感，而甲醇沉淀蛋白是成絮状的、乙腈沉淀蛋白是成小块状的，絮状的更有利于药物的溶出，因此，用甲醇更有利于低血药浓度药物的提取。本试验在此色谱条件下测得的黄芩苷精密度好，回收率高，血药有效成分峰和杂质峰分离清楚,灵敏度高，说明该方法稳定，快速准确，简便可行，可以作为本试验血药浓度监测的手段。

本试验所得血药浓度-时间数据经药代动力学软件PKS(Pharmaceutical KineticsSoftware)处理药时数据，根据F检验和AIC值选择房室数，2组家兔口服黄连解毒散超微细粉、细粉后，其有效成分黄芩苷在其体内的代谢过程符合一级吸收二室开放模型。说明黄连解毒散超微细粉和细粉的有效成分黄芩苷在家兔体内的代谢方式基本相似。有文献报道家兔口服银黄冲剂，银黄冲剂中的代表成分黄芩苷在家兔体内的药时过程也符合一级吸收二室开放模型，但其消除非常缓慢，消除半衰期达到341.5h，与本试验的5.83-8.46h相比，差异很大，这可能与试验方剂的不同有关，黄连解毒散中含有利胆作用较强的栀子，这种成分可能对黄芩苷的排泄产生某些显著影响，因为黄芩苷是含羟基的黄酮类化合物，极性较强，有利于血中的快速消除，而且黄酮类化合物的胆汁排泄是其排泄的主要途径。

黄连解毒散超微细粉组和细粉组比较，Tpeak缩短了0.640h；Cmax提高了43.98%；AUC反映药物的生物利用度，其中超微细粉、细粉AUC分别是3.401 (μg・h /mL) 和2.611(μg・h/mL)，与细粉比较，黄连解毒散超微细粉中黄芩苷的相对生物利用度提高了30.26%，表明超微细粉比细粉生物利用度大。一般对固体药物来说，溶出是吸收的前提，药物粉体粒径越小，比表面积越大，溶出越快，吸收越好。在理论上，散剂的粒子越细，比表面积愈大，进入体内的粒子与体液较大的接触面积，可使药物较快的溶解和吸收。中药经过超微粉碎后，使细胞破壁率达95%以上，颗粒细、混合均匀，其有效成份充分暴露出来，在胃液作用下即被溶解，进入小肠后一开始即被同步吸收，起效迅速；另外，中药超微细粉因其超微粉粒子吸附力的作用，使药物在消化道内的作用时间较长，提高了药物吸收率，同时药物有效成份由细胞内向外迁移所需时间短，吸收明显加快且吸收量增大、吸收更完全。药物的生物利用度与药物成分的溶出量和溶出速率在一定程度上具有相关性，因此通过降低药物粉体的粒径可改善药物的溶出速度，提高生物利用度。本实验研究表明中药经超微粉碎后其有效成分可更快、更多的吸收，对提高中药有效成分的生物利用度具有积极的意义。

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