猪圆环病毒（porcine circovirus,PCV）是由Tischer 等于1974年在PK-15细胞中发现的。病毒粒子为20面体对称，以滚环方式进行复制，可在PK-15细胞上生长，但不引起细胞病变，现将其归为圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属。PCV主要由衣壳蛋白和基因组组成，存在两种血清型，即PCV-1和PCV2。PCV-1无致病性，基因组总长为1.759×103 bp，包含7个读码框架，广泛存在于猪体各器官组织及猪源细胞中。PCV2首先由Allan等从患断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的猪群中分离到，被证明为PMWS的重要病原。患猪表现为明显食欲不振、生长迟缓、皮毛不整、皮肤苍白，常伴有黄疸和低烧，如并发感染会加剧死亡，不死者多变成僵猪。剖检可见患猪表现为全身淋巴结肿大，间质性肺炎，脾轻度肿大，肝硬变等。PMWS既可水平传播，导致断奶仔猪发病死亡，亦可垂直传播，引起繁殖障碍。目前在中国、德国、法国、西班牙、加拿大、美国、日本、印度等国家和中国台湾地区已有检测到PCV2的相关报道。PCV2常和猪呼吸和繁殖综合征病毒（PRRSV）、细小病毒（PPV）、伪狂犬病病毒（PRV）混合感染，造成猪的免疫失败。PCV2基因组为1 768 bp或1 767 bp，含有11个阅读框。PCV-1、PCV2均包含有2个主要的开放阅读框（ORF）即ORF1和ORF2。ORF1在两株PCV间相对保守，ORF2可变性较大。二者的主要结构蛋白均由ORF2编码，而ORF1则与病毒的复制有关。?
本实验旨在用PCR方法扩增到PCV2江西病料的全基因组，并对其序列进行分析，从而为该病毒的分子生物学、流行病学等作一研究。?
1 材料与方法
1.1可疑病料 从江西猪种中采集表现PMWS症状断奶仔猪的肝、肺、淋巴结等病料，分装后－20℃保存备用。
1.2DNA提取 取肺门淋巴结、脾脏组织少量，分别加入约4倍体积的组织裂解缓冲液冲洗研磨后6 000 r/min离心35 min后取上清液。按终浓度20 μg/ml?加入胃蛋白酶K，50℃消化2 h。再依次用等体积的饱和酚，等体积的酚/氯仿/异戊醇（25∶?24∶?1）提取组织中的总DNA。然后用无水乙醇沉淀DNA，并将其溶解在无DNA酶的TE缓冲液（pH7.5）中，－20℃保存待用。
1.3引物设计根据NCBI上PCV2的序列，并对国内外已使用的引物进行筛选，采用如下两对引物：?
引物1：5′?CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3′?
引物2：5′?CTCGGCTATGCGCTCCAAAAT-G-3′?
引物3：5′GATTTTGTTGGTCCCCCCTC3′?
引物4：5′TTTAGTCTCTACAGTCAATG3′?
引物1、2扩增长度为1 154 bp，引物3、4扩增长度1 069 bp,扩增的两片段重叠区超过450 bp。引物由TaKaRa公司合成，为冻干粉，用前溶解于灭菌超纯水，浓度为20 pmol/μl,－20℃保存。?
1.4PCR反应 两片段PCR扩增采用相同条件。所加PCR成分为：1×PCR buffer，2.5 mmol的MgCl2，0.2 mmol的dNTPs，0.4 μmol的引物，2 U的Taq聚合酶 。PCR扩增条件设置为：94℃变性?5 min?之后进行35个循环（94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min），72℃延伸8 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。?
1.5 PCR扩增产物纯化回收将PCR产物琼脂糖电泳，切割所得特异性扩增条带，用胶回收试剂盒回收。
1.6 测序分析 测序工作由上海生工完成，应用DNA Star软件对基因序列做分析比较并绘制系统发生树。?
2 结果
2.1PCR扩增 PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，成像系统分析可见，7个PCR扩增产物中都出现特异条带，大小与预期相符，分别为1 156 bp和1 069 bp。?
2.2 序列分析 经测序，待检的江西猪场的病料PCV2全基因全长，A株为1 767 bp，B株为1 768 bp，与资料报道相一致。将所测序列与GenBank中的其他已知参考毒株进行比较。所选序列包括3个美国株（USA），5个加拿大株，1个荷兰株，2个法国株，1个西班牙株，2个德国株，2个中国台湾株，及中国大陆各地区共6个。结果显示，本研究的2个分离株与世界上其他不同地区的23个已知的PCV2分离株的基因组序列密切相关，各个核苷酸序列之间的同源率在95.4%～99.8%。本实验所测的两病料全序列核苷酸同源率为99.4%。A、B株和国内的毒株的同源性普遍较高均在96%以上，它们都与加拿大的AF027217同源率最高(分别为99.8%和?99.5%?)；从总体上来说两个分离株与法国、部分加拿大的同源性普遍高于美国、瑞典、德国、荷兰等国。本研究的2个分离株及其他己知的PCV2分离株之间的全基因组序列同源率见表1。从上述的比较来看在PCV2进化上有着一定的地理位置上的差异，通过DNAstar分析生物学软件所绘制的PCV2全基因组进化树(图3)可以看出除北京和中国台湾外中国大多分离株均在一个较大的分支上，其中本研究所分离的A株被单独分支，B株则和一个江苏分离株也独立成为其中一个小分支；而另一个较大的分支则主要由美洲株组成，在这个分支上还有一个德国分离株和一个西班牙分离株，它们也都各自独立分支；另外，还有一个江苏分离株与其他地域的分离株差异较大而单独成一支。?
3 讨论
资料表明，PCV2是PMWS的主要病因，本实验从江西猪PMWS可疑病料中成功扩增到了PCV2片段并进行了测序，进一步证实了PCV2与PMWS的相关性，病料中是否还存在其他病原还需进一步研究。
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