高效毛细管电泳检测牛奶中氨苄青霉素和阿莫西林残留方法的建立

摘　要：建立了高效毛细管电泳同时检测牛奶中残留氨苄青霉素和阿莫西林的方法。牛奶样品采用三氯乙酸溶液沉淀蛋白，在30mmol/L硼砂缓冲液，pH 7.8，检测波长198 nm，运行电压18 kV，温度25℃的电泳条件下，两种药物完全分离。氨苄青霉素在10 μg/mL～100 μg/mL的浓度范围内线性良好相关系数为0.9989，阿莫西林在5 μg/mL～100 μg/mL的浓度范围内线性良好相关系数为0.9998。两种药物的平均加标回收率范围为80%～92%，变异系数(CV)范围为3.02%～10.11%。该方法检测牛奶中残留的氨苄青霉素和阿莫西林较为快速、简便。

关键词：高效毛细管电泳；氨苄青霉素；阿莫西林；牛奶；残留

氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)和阿莫西林(Amoxicillin，Amo)属于青霉素类抗生素，具有广泛的抗菌谱以及良好的药物学稳定性，不仅是医学上的重要抗感染药物，也是目前畜禽养殖业中动物疾病预防和治疗的常用药物，因此对动物性食品中青霉素类抗生素残留的有效监测，已经成为保障食品安全的一个重要环节。在奶牛疾病的治疗与预防中，药物使用不合理将造成其在奶产品中的残留，直接危害人类健康。目前，牛奶中青霉素类抗生素残留检测多使用微生物法、薄层色谱法和高效液相色谱法。毛细管电泳作为一种新型药物残留检测技术具有简易、快速、试剂消耗少、污染少、重现性好和易自动化等优点，具有广泛的应用前景。本试验使用毛细管电泳法同时检测牛奶中残留的氨苄青霉素和阿莫西林。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　仪器　P/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国贝克曼公司)；弹性石英毛细管柱50 μm×60cm(河北永年光纤有限公司)；雷磁PHS-3C精密pH计(北京泰亚赛福科技发展有限责任公司)； AnkeTGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)； WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；Milli-Q纯水仪。

1.1.2　试剂和样品　氨苄青霉素标准品，批号K0210603，含量86.5%，中国兽医药品监察所；阿莫西林标准品，批号130409-200609，含量86.6%，中国药品生物制品检定所；试验过程所用试剂均为国产分析纯；试验用水为1.8MΩ超纯水；牛奶为市售不含抗生素纯奶。

1.1.3　溶液的配制　标准溶液用超纯水分别配制浓度为1 000 μg/mL的氨苄青霉素和阿莫西林标准品储备液，置4 ℃冰箱避光保存。

缓冲溶液配制30 mmol/L硼砂缓冲溶液，用6 mol/L HCl调节pH，经0.45 μm滤膜过滤后备用。

1.2　方法

1.2.1　牛奶样品的处理　将大约50 mL牛奶以3 500 r/min离心10 min后弃去上层乳脂，精密量取下层液4.0 mL于7mL离心管，加入0.4 mL 0.2 g/mL三氯乙酸溶液，以2 000 r/min旋涡混匀30 s，放置数分钟，以6 500r/min离心10 min，经0.2 μm滤膜过滤后供毛细管电泳分析。

1.2.2　毛细管电泳分析条件　弹性石英毛细管柱(50 μm×60 cm)，分离电压18 kV，检测波长198 nm，温度25℃，0.5 psi进样5 s，运行缓冲液为30 mmol/L硼砂缓冲液，pH 7.8(用6 mol/LHCl调节)。每次进样前均水洗3 min，缓冲液洗4 min。

1.2.3　标准曲线与工作曲线绘制

1.2.3.1　标准品标准曲线绘制　将氨苄青霉素和阿莫西林标准品储备液1∶1混合后逐级稀释，依次获得浓度为5、10、20、40、60、80、100μg/mL的标准工作液，供毛细管电泳分析，将各个浓度水平样品所测得的峰面积(A)与浓度(C)进行线性回归，得到氨苄青霉素和阿莫西林两种抗生素的标准曲线方程和相关系数。

1.2.3.2　工作曲线绘制　将氨苄青霉素和阿莫西林标准品储备液1∶1混合后逐级稀释，依次获得400、320、160、80、40、20μg/mL的标准工作液。取新鲜牛奶3 mL于数支7 mL离心管，分别加入1mL氨苄青霉素与阿莫西林混合标准工作溶液，制得牛奶中氨苄青霉素与阿莫西林添加浓度均为100、80、40、20、10、5μg/mL。旋涡混匀，按照上述前处理方法处理，上清液供毛细管电泳分析。将各个浓度水平样品所测得的峰面积(A)与浓度(C)进行回归分析，得到氨苄青霉素和阿莫西林两种抗生素的标准曲线方程和相关系数。

1.2.4　最低检测限和定量限的确定　按照上述前处理方法制备20个空白样品，进行毛细管电泳分析，以空白样品在所测药物出峰时间处的峰面积平均值与3倍标准差之和为检测限，以空白样品在所测药物出峰时间处的峰面积平均值与10倍标准差之和为定量限。

1.2.5　精密度及回收率测定　制备添加药物浓度为20、40、80μg/mL的牛奶样品，按照上述前处理方法处理后上机测定，每个浓度均重复6次，计算变异系数及回收率。

2　结果

2.1　电泳分析条件的选择

进行了四因素三水平正交试验，最终确定最佳电泳条件。首先考察了磷酸氢二钠/磷酸二氢钾、硼砂/磷酸二氢钾、硼砂/盐酸缓冲体系对氨苄青霉素和阿莫西林分离的影响，发现氨苄青霉素和阿莫西林在硼砂/磷酸二氢钾缓冲体系中出峰最快，但在硼砂/盐酸缓冲体系分离效果最好，分离度大于1.8。对离子浓度在10mmol/L～50mmol/L范围内进行初步筛选，随离子浓度升高药物出峰时间后延且分离度降低，未能达1.5，离子浓度在10、25、30 mmol/L3个水平均能达良好分离。考察了硼砂/盐酸缓冲体系在pH7.6～9.0范围对两种药物分离的影响，发现pH对两者分离影响较大，pH≥8.5时两峰不能完全分离，pH为7.6、7.8、8.0三个水平时两者可完全分离，峰型好。对分离电压在16kV～28 kV范围内进行初步筛选，确定18、20、22 kV 3个电压水平，对温度在15 ℃～30℃范围内进行初步筛选，确定20、25、30 ℃3个温度水平。通过四因素三水平正交试验，以峰面积为考察参数，其中缓冲液离子浓度、pH、分离电压对峰面积的影响均达极显著水平，在确定的最佳电泳条件下氨苄青霉素与阿莫西林完全分离且峰形好。

2.2　除蛋白试剂的选择

本试验比较了三氯乙酸与乙腈对牛奶蛋白的沉淀效果的影响，三氯乙酸效果较佳，基本可完全沉淀牛奶蛋白，乙腈则不能有效去除牛奶蛋白。比较了0.75g/mL与0.2 g/mL三氯乙酸对牛奶蛋白的沉淀效果的影响，结果无显著差异，比较了0.2g/mL三氯乙酸加入比例为10∶1与5∶1时对牛奶蛋白的沉淀效果的影响，结果无显著差异。

2.3　标准曲线与工作曲线

2.3.1　标准品标准曲线测定　在确定的最佳毛细管电泳条件下，配制一系列不同浓度的标准溶液进行毛细管电泳测定以峰面积(A)对浓度(C)绘制标准曲线，线性关系和相关系数见表1。结果表明，氨苄青霉素和阿莫西林标准品在5μg/mL～100 μg/mL范围内线性良好。

2.3.2　工作曲线　在确定的最佳毛细管电泳条件下，牛奶中添加Amp浓度在10 μg/mL～100 μg/mL范围和Amo浓度在5μg/mL～100μg/mL范围时进行毛细管电泳测定，以峰面积(A)对浓度(C)绘制标准曲线，线性关系和相关系数见表2。结果表明，添加氨苄青霉素在10μg/mL～100 μg/mL范围内线性良好，添加阿莫西林在5 μg/mL～100 μg/mL范围内线性良好。

2.4　最低检测限和最低定量限

本试验氨苄青霉素的最低检测限为0.12 μg/mL，定量限为3.6 μg/mL；阿莫西林的最低检测限为0.23μg/mL，定量限为1.08 μg/mL。

2.5　精密度及回收率

制备添加药物浓度为20、40、80μg/mL的牛奶样品，按照上述前处理方法处理后上机测定，每个浓度均重复6次，回收率及变异系数见表3。

表1　标准品线性关系与相关系数

Table 1　Linear relationship and correlation coefficient of Standard

表2　牛奶中添加药物线性关系与相关系数

Table 2 Linear relationship and correlation coefficient of milksamples spiked with Ampicillin and Amoxicillin standard

Table 3　Recoveries and coefficient of variation of milk samplesspiked with Ampicillin and Amoxicillin standard(n＝6)

2.6　毛细管电泳色谱图

结果见图1～图3。

图1　氨苄青霉素和阿莫西林浓度为100 μg/mL的毛细管电泳图

Fig.1　The HPCE graphs of Ampicillin and Amoxicillin standard with aconcentration of 100 μg/mL

图2　空白牛奶样品毛细管电泳图

Fig.2　The HPCE graphs of blank milk samples

图3　牛奶中添加氨苄青霉素和阿莫西林浓度为80 μg/mL的毛细管电泳图

Fig.3　The HPCE graphs of milk samples spiked with Ampicillin andAmoxicillin standard with a concentration of 80 μg/mL

2.7　样品分析

使用上述方法对市售6种品牌纯牛奶进行了测定，均未检出氨苄青霉素和阿莫西林的存在。

3　讨论

毛细管电泳法检测牛奶中残留的青霉素类抗生素目前在国内鲜有报道。2006年Santos SM等曾报道毛细管电泳法同时测定添加在牛乳中的6种β-内酰胺类抗生素，结果与本试验无显著差异，但本试验在前处理方法上有所改进，较之简单、快速、经济。

有文献报道使用高效液相色谱法检测牛奶中氨苄青霉素检测限可达1μg/L，与之相比毛细管电泳方法作为一种新型的药物残留检测方法虽具有自己的优点，但残留的检测限水平较低，本试验使用PDA(二级管阵列)检测器，检测限不甚理想，激光诱导荧光检测器可提高仪器灵敏度。