H9N2亚型禽流感病毒疫苗研究进展

摘　要：H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在，给养禽业造成巨大的经济损失，并危害人类健康。流感病毒抗原易发生漂移和转换，使流感病毒的防控变得困难。疫苗接种是防控禽流感最有效的手段之一，全病毒灭活疫苗保护效果好，制备简单，是流感病毒常用的疫苗，但该疫苗局部副反应大，并伴随生物安全问题。随着分子生物学技术的发展，活载体疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的开发，给H9N2亚型禽流感病毒的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外，在生物安全和普遍防控方面具有广泛的优势，是流感病毒疫苗发展的新方向。

关键词：禽流感病毒；H9N2亚型；疫苗

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒(Avian infnenzavirus，AIV)引起的一种禽类的高度接触性传染病，鸡、火鸡、鸭、鹅和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。A型流感病毒属于正黏病毒科，基因组是负义单股RNA，分为8个片段。根据表面抗原血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的抗原性不同，可将A型流感病毒分成若干亚型，目前，已发现了16种HA和9种NA亚型。A型流感病毒具有宿主特异性，感染禽类并致病的通常是H5、H7和H9亚型。H9N2亚型禽流感病毒最早于1966年从北美的火鸡体内分离得到，1994年开始在中国大陆的家禽中出现，最近几年在经济性家禽中普遍暴发。H9N2亚型虽然为低致病性禽流感病毒(Lowlypathogenic avian influenza virus，LPAIV)，但可造成蛋鸡的产蛋量严重下降，肉鸡和青年鸡的复合型呼吸道疾病和死淘率升高，往往造成严重的经济损失。1999年出现的H9亚型AIV感染人的事件，更是给人类的健康带来了巨大威胁。H9亚型禽流感病毒在经济上和公共卫生上的重要地位，越来越引起人们的广泛关注。与其他病毒性疾病一样，禽流感的防治尚无特别有效的方法，接种疫苗是预防禽流感发生与传播的最有效手段。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，为禽流感新型疫苗的开发提供了理论依据和技术手段，除传统的灭活疫苗外，还进行了活载体疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗等方面的探索，本文就近年来H9N2亚型禽流感疫苗的研究现状做一综述。

1　灭活疫苗

灭活全病毒疫苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚尿囊增殖液，并辅以佐剂制成，有良好的免疫作用。根据需要可制备针对几种不同亚型病毒的多价疫苗。李明义等用A型禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/77420/96(LPAI-H5N2)株及A/Chicken/Shanghai/1/98(H9N2)株分别接种易感鸡胚，收获感染胚液超滤浓缩后经甲醛灭活，加油佐剂混合乳化制成油乳剂灭活疫苗。疫苗接种4周龄SPF鸡，试验表明疫苗安全。取疫苗1羽份接种4周龄SPF鸡进行效力试验，免疫鸡群全部获得保护，对照鸡群全部感染或死亡。经不同免疫剂量测定，证明1羽份疫苗至少含有8个免疫剂量。免疫干扰试验证明两种抗原具有免疫协同作用。

禽流感、新城疫、传染性支气管炎对鸡群危害巨大，且免疫程序相近，为减少接种次数，达到更好的保护效果，多制成联苗进行免疫防控。刘佃章等用本地分离的禽流感病毒H9毒株和新城疫病毒LaSota株经鸡胚增殖，灭活后制成禽流感H9、新城疫二联灭活油佐(乳)剂疫苗，经效力检验和攻毒试验，5日龄白羽肉鸡免疫后15d，抗体效价可达1∶32以上，并能够保护免疫鸡免受禽流感病毒的自然感染，新城疫病毒的抗体效价也达到较高的水平。2007年1月，洛阳普莱柯生物工程有限公司宣布禽流感(H9N2)、新城疫、传染性支气管炎三联灭活疫苗研制成功，对3万多只鸡的临床试验证实疫苗安全有效。禽流感三联苗不但有效解决了新城疫、传染性支气管炎、禽流感等3种病毒病免疫程序接近，免疫间相互干扰，重复免疫应激等生产应用中的重大问题，而且使用成本仅为单苗相加的50%。灭活疫苗制备工艺简单，免疫保护效果较好，能有效避免禽流感的大规模暴发和流行。

2　基因重组活载体疫苗

重组鸡痘病毒疫苗是一类研究较为深入、具有广阔应用前景的禽用基因工程疫苗，用于构建重组鸡痘病毒的载体一般为鸡痘病毒疫苗株，它们的毒副作用小，安全性高。扩增禽流感病毒HA基因，插入鸡痘病毒载体使其表达HA蛋白，制成基因重组活载体疫苗，抵御禽流感病毒的攻击。陈平等将禽流感病毒H9亚型HA基因克隆插入载体pFG11S中，与禽痘病毒疫苗株(wFPV)共转染鸡成纤维细胞(CEF)得到重组病毒rFPV-Ps-HA，以间接免疫荧光法证实HA基因得到了表达。将该病毒经颈部皮下接种1日龄SPF鸡，接种后15d以H9亚型禽流感病毒F株翅静脉攻毒，攻毒后第5天采集泄殖腔棉拭子样品进行病毒分离，发现疫苗组均能很好地抑制排毒，攻毒对照组泄殖腔的排毒率明显高于气管排毒率。陈素娟等应用相同的技术构建了同时表达H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒，初步动物试验表明，用该重组鸡痘病毒免疫SPF鸡，免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100%(8/8)；该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒，同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击，保护率均为100%，具有一定的应用前景。程坚等构建了共表达H9亚型HA基因和IFN-Ⅱ的重组鸡痘病毒，不仅能显著抑制静脉攻毒后1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒，且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒抑制1日龄SPF雏鸡增重的副作用。

3　亚单位疫苗

亚单位疫苗是利用病原微生物表面结构成分制成的不含核酸，能诱导机体产生保护性免疫应答的疫苗。禽流感亚单位疫苗是提取禽流感具有免疫原性的蛋白，加以佐剂制成的。随着重组DNA及分子克隆技术的发展，可以将表面基因连接到载体质粒，然后导入表达系统中，经诱导可获得大量表达的免疫原性蛋白，加入佐剂制成基因工程亚单位疫苗。

Pushko P等扩增H9N2亚型流感病毒A/Hongkong/1073/99(H9N2)株的HA、NA和M1基因，克隆至pFastBac1杆状病毒转移载体上，转染昆虫细胞系sf9，获得大量表达的HApNA和M1蛋白，并自动组装成直径为80nm～120nm的病毒样颗粒，该病毒样颗粒具有流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)活性，肌肉注射免疫Balb/c小鼠，抗体效价在104～105之间，能有效阻止流感病毒在上呼吸道和肺部的复制。PushkoP等在重组的HA蛋白中加入Novasome佐剂，增强了重组蛋白的免疫原性，使用更少的重组蛋白即能产生良好的免疫效果。杆状病毒表达系统由于具有蛋白翻译后加工过程，与原核表达的蛋白相比更接近病毒蛋白的原始构象，在亚单位疫苗的开发中具有良好的运用前景。

4　核酸疫苗

核酸疫苗又称DNA疫苗，是利用重组DNA技术将编码保护性抗原蛋白的基因克隆到真核表达载体上，在被直接导入到动物体内后，保护性抗原蛋白基因表达的抗原蛋白经内源性途径呈给免疫系统，诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。QiuMZ等用H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/7/2002株感染Balb/c小鼠，传至5代后，A/Chicken/Jiangsu/7/2002株能在小鼠肺内稳定增殖，并能致死小鼠。用表达同源H9N2亚型的HA和NA基因的核酸疫苗免疫小鼠，一免或二免后用致死量的A/Chicken/Jiangsu/7/2002株攻毒，观察小鼠存活时间，测定小鼠血清抗体效价和肺组织内病毒残留滴度对免疫保护效果进行评价。结果显示，用10μg表达HA和NA基因的核酸疫苗免疫一次能有效保护同源H9N2亚型禽流感病毒的攻击。

核酸疫苗能长时间表达抗原，避免母源抗体的干扰，并且没有散毒及毒力回升的危险，但现今开发的核酸疫苗存在在体内表达效率不高，免疫保护效果不好等缺点，需要进行进一步的研究才能用于实际生产。

5　通用疫苗

禽流感病毒亚型众多，各亚型表面抗原基因易发生漂移和转换，是流感病毒防控的难点，如何能寻找一种“通用疫苗”，对各亚型具有交叉保护，是流感病毒防控策略之一。研究表明，A型流感病毒M2蛋白在各亚型之间相对保守，是有效的疫苗靶点，为通用疫苗的开发奠定了理论基础。ErnstWA等扩增H1、H5和H9亚型流感病毒M2蛋白外功能区M2eA表位片段，将其融合构建于带有疏水蛋白的表达载体(如pET28a)上进行融合表达，以脂质体为佐剂免疫小鼠。结果表明，M2eA表位疫苗能刺激机体产生针对M2eA表位的IgG亚型抗体，显著减少流感病毒在呼吸道的复制和增殖，用致死量的同源性H1N1和H9N2亚型病毒攻击免疫小鼠，保护率分别为100%和80%，用致死量的H6N2亚型流感病毒进行攻击，保护率为100%。表明M2eA表位疫苗对各亚型流感病毒均有一定保护效果，为流感病毒通用疫苗的研究奠定了基础。

6　反向遗传技术在禽流感疫苗开发中的运用

反向遗传技术(reverse genetics)又叫“病毒拯救(rescue ofvirus)”，是近几年研究的一项新方法，应用于病毒研究。病毒拯救技术是在了解病毒复制的特点等的基础上，利用分子生物学技术建立和完善起来的，是通过人工操作基因，用病毒核酸的适当形式在一定条件下转染细胞，产生有感染性的病毒粒子。经过多年的发展，现在病毒拯救指的就是完全以质粒为基础的系统，即从克隆的cDNA产生病毒的过程。病毒拯救在对病毒的生活周期、基因结构与功能、致病基础、新型疫苗构建、表达外源蛋白等方面的研究中显示了良好的应用前景。NeumannG等分别报道了完全以质粒为基础的流感病毒拯救，允许人工对流感病毒基因进行操作，引入预期突变位点，使重组病毒具有预期(冷适应、减毒等)表型，为流感病毒新型疫苗的开发提供了有力工具。反向遗传技术已成功用于人用流感病毒减毒活疫苗的开发，2003年在美国，应用反向遗传技术开发的流感病毒减毒三价活疫苗FluMist?被批准和投入使用，该流感减毒活疫苗在成年人和儿童中都有良好的安全性，可以有效预防流感。该技术也已用于禽流感病毒的研究，石火英等应用反向遗传技术将含有1998年中国大陆分离株H9N2 亚型禽流感病毒的8个基因片段的质粒共转染COS-1细胞，产生了与野生病毒生物学特性相同的H9N2亚型AIV。应用反向遗传技术，可将具有低致病性的H9N2亚型禽流感病毒作为骨架病毒，与不同毒株的表面HA、NA基因进行重组，产生重配病毒，作为候选疫苗。可以预见，反向遗传技术将是以后开发有效禽流感病毒疫苗候选株的有力手段。

7　结语

禽流感病毒的亚型众多、分布广泛、传播渠道复杂，病毒自身的特点和疫苗选择压力使病毒容易发生重组、重排而使其抗原性和致病性发生变化，造成免疫失败，这些特点给禽流感的防治工作带来了很大的困难。H9亚型禽流感病毒对鸡群的低致病性更使人容易忽略，因此，对禽流感病毒进行连续的分子病毒学监测，分析禽流感病毒变异规律，筛选出合适的疫苗株，应用先进的分子生物学技术研制出高效、安全、工艺简单、价格低廉的禽流感疫苗是禽流感病毒研究者努力的方向。